3.1 重组DNA技术的基本工具 课件 2023—2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3

3. 1. 1重组DNA技术的基本工具 DNA 大肠杆菌细胞 抗菌素抗性基因 控制质粒DNA 转移的基因 质粒 1953年沃森和克 1967年，科学家发 20世纪70年代初，多 种限 1973年，科学家证明了质 1985年，穆 里克建立了DNA 现，在细菌拟核 制酶、DNA 连接酶和逆转 粒可以作为基因工程的载 里斯等人发明 双螺旋结构模型 DNA 之外的质粒有 录酶被相继发现。这些发 体，构建重组DNA, 导 入 PCR ,为获取目 并提出了遗传物 自我复制能力，并 现为DNA 的切割、连接以 受体细胞，使外源基因在 的基因提供了 质自我复制的假 可以在细菌细胞间 及功能基因的获得创造了 原核细胞中成功表达，并 有效手段。 说。 转移。 条 件。 实现了物种间的基因交流。 至此，基因工程正式问世。 1944年艾弗里等人通过 1961年尼伦伯格和马 1970年科学家在 1972年， 伯格首 1982年，第一个基因工 肺炎链球菌的转化实验， 太破译了第一个编码 细菌中发现了第 先在体外进行了 程药物-重组人胰岛素被 不仅证明了遗传物质是 氨基酸的密码子。截 一个限制性核酸 DNA 的改造，成 批准上市。基因工程药 DNA, 还证明了DNA 可 至19666年，64个密 内切酶 (简称限 功构建了第一个 物成为世界各国研究和 以在同种生物个体间转 移。 码子均被破译成功。 制酶) 体外重组DNA分 于。 投资开发的热点。 基因工程发展历程 从社会中来 番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。当番木瓜 受到这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过 精心设计用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它 可以抵御番木瓜环斑病毒。 DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进 行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分 子工具”。那么,科学家究竟用到了哪些“分子工 具”?这些“分子工具”各具有什么特征呢? 转基因实际就是基因工程，那么什么是基因 工程，需要那些工具? 一 、基因工程 就是按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传 特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，从技术 操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的， 因此又叫做重组DNA技术。 1、原 理 ：基因重组 2、操作水平： DNA 分子水平 3、结 果 ：定向地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的生物类型 和生物产品 拓展1: 基因工程诞生的理论基础 1、不同生物的基因为什么能拼接? (1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。 (2)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。 2、外源基因为什么能在受体细胞中表达? (1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。 (2)遗传信息的传递都遵循中心法则。 (3)生物界共用一套遗传密码。相同的遗传信息在 不同的生物体内表达出相同的蛋白质。 (一)分子手术刀---限制性内切核酸酶 (二)分子缝合针---DNA连接酶 (三)分子运输车---运载体 二 、 重组DNA 技术的基本工具 重组DNA 技术 的基本工具： 分子运输车 (一)分子手术刀--- 限制性内切核酸酶(限制酶) 1、来源：主要从原核生物中分离纯化来的 2、种类：数千种 3、特点： 能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特 定部位的磷酸二酯键断开。 C G 黏性末端 C 平末端 4、作用部位： 特定切点上的 磷酸二酯键 5、结果： 形成黏性末端 和平末端 中轴线 中轴线 (1)EcoRI 限制酶的切割 EcoRI只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的 核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。 黏性末端 黏性末端 (2)SmaI 限制酶的作用 Smal只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单 链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。 平末端 平末端 限制酶所识别序列的特 点是： 呈现碱基互补对称， 无论是6个碱基还是4个碱基， 都可以找到一条中心轴线； 中轴线两侧的双链DNA上的 碱基是反向对称重复排列 的，称为回文序列。 在切割部位， 一条链正 向读的碱基顺序与另一条链 反向读的顺序完全一致。 Taql C (3)限制酶的识别序列 BamHI HindlI1 EcoRI G 资料1——限制酶名字的由来 用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的 略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。 例如一种限制酶是从大肠杆菌(Escherichia coli) 的R型菌株分离 来的，就用字母EcoR表示； 如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步 表示成EcoRI 。 小练习： 粘质沙雷氏杆菌(Serratia marcesens) 中分离的第一种限制 酶 即 Sma I 想一想： 1、要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口? 可产生几个黏性末端? 供体生物细胞 要 切两 个切 口 ， 产 生四 个黏性末端。 2 、如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶 取出DNA 切割，会怎样呢? 会产生相同的黏性末端 限制酶 目的基因 3、你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗? 原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的 进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的 侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入 时，会利用限制酶将外源DNA 切割掉，以保证自身的安全。 所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、 使之失 效，从而达到保护自身的目的。 练习与应用拓展应用1 1、 为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA? 通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其 DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲 基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将 其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的 DNA被切断，并且可以防止外源DNA 的入侵。 哪种限制酶切割B片段产生的DNA 片段能与限制酶Spe I切割的A片段产生 的DNA片段相连接，为什么? Xba I 因为Xba I与Spe I切割产生了相同的黏性末端(可互补) 练习与应用拓展应用2 有2个不同来源的DNA片段A和B,A 片段用限制酶Spe I进行切割，B片段分 别用限制酶HindⅢ 、Xba I 、EcoRV和Xho I进行切割，各限制酶的识别 序列和切割位点如下： -TTCGAA- -CTATAG- Xho I -CTCGAG- -GAGCTC- SpeI -ACTAGT- -TGATCA- Hind Ⅲ -AAGCTT- Xba I -TCTAGA- -AGATCT- EcoRV -GATATC- 用同种限制酶切割(EcoR I) T T A 思 考： 把两种来源不同的DNA 进行重组，应该怎样处理? AA T T C T T A A G C T T A A G 缺口怎么办? 1.作用： 将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复 被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷 酸二酯键 。 2.种类：(1)E·coli DNA连接酶 (2)T₄DNA 连接酶 两种酶的作用对象是不是一样的? (二)分子缝合针—-DNA连接酶 可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来， 即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 (1)E·coli DNA连接或T₄DNA 连接酶连接粘性末端 T T A (2)T₄DNA 连接酶可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，效率低 类型 来源 功能 相同点 差别 E·coliDNA连接酶 大肠杆菌 恢复磷酸 二酯键 只能连接黏性末端 T₄DNA连接酶 T₄ 噬菌体 能连接黏性末端和 平末端(效率较低) P72旁栏思考：DNA 连接酶与DNA 聚合酶是 一回事吗?为什么? (3)E·coli DNA连接酶与T₄DNA 连接酶比较： T DNA聚合酶DNA聚合酶NA 聚合酶NA 聚合酶DNA聚合酶 A A T (4)DNA 聚合酶的作用 T DNA连接酶 DNA聚合酶 相 同 点 作用实质 都能催化形成磷酸二酯键 化学本质 都是蛋白质 不 同 点 模板 不需要 需要DNA的一条链作模板 作用对象 在两个DNA片段之间 形成磷酸二酯键 只能将单个核苷酸连接 到已有的DNA片段上， 形成磷酸二酯键 作用结果 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链 用途 基因工程 DNA复制 (5)DNA 连接酶与DNA 聚合酶的比较： 种类 作用底物 作用部位 形成产物 D N A 连 接 酶 DNA分子片段 磷酸二酯键 重组DNA分子 D N A 聚 合 酶 脱氧核苷酸 磷酸二酯键 新的DNA分子 限制酶 DNA分子 磷酸二酯键 含黏性末端或平末端的 DNA片段 解旋酶 DNA分子 氢键 单链DNA 拓展2:比较以下几种酶 项目 内容 载体类型 质粒、入噬菌体的衍生物、动植物病毒等 作用 将外源基因送入受体细胞的工具 条件 雷受体脆龙害多个限制酶切点，你会用它做载体吗? 有果载体毁角命跟制酶物会割怎僻点，供外源基因插入 能在蓿图细胞中复制异稳是地保存L 火 基因生物能产生 填侑确特殊的株地基因进入供動细胸中A的鉴定和选择 (三)分子运输车---运载体 4、基因工程使用质粒的特点 在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是天然质粒的基 础上进行过人工改造的，这些质粒上常有特殊的标记基因，如四环素 抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，便于重组DNA分子的筛选； 拟核DNA 质粒 大肠杆菌细胞 氨苄青霉素 抗性基因 复制原点 含有抗氨苄青霉素 基因的重组 ， 有的没有重组质 有重组质粒进入 大肠杆菌中有的 质粒 抗性 只有含有重组质粒， 并且重组质粒上的 基因表达的大肠杆 菌才能存活并增殖 在含有氨苄 青霉素的培 养基上培养 大肠杆菌及质粒结构模式图 进入受 体细胞 目的基因 插入位点 粒进入 Amp GGATCC CCTAGG 酶 ① 抗生素A 抗性基因 质粒 抗生素B 抗性基因 CTAG 酶 ③ 1.在培养细菌的培养基中添加抗生素B, 则应选择的限制酶为①或② 2.在培养细菌的培养基中添加抗生素A, 则应选择的限制酶为 ① *酶③也会切割酶②识别的序 列，因此不能选择酶③ 现学现用： 选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌筛选出 CCGG GGCC 酶 ② 来 GATC 思考·讨论 P73 5'-ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC-3' 3'-TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG-5' 5'-TCCTACAATTCTCGGTATCAATTCCATAC-3' 3'-AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG-5' (1)剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。 (3)不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。 特点： 具有专一性 作用部位：磷酸二酯键 结果： 形成黏性末端或平末端 作用： 把两条双链DNA片段拼接起来 连接部位：磷酸二酯键 种类： E.coliDNA连接酶、T₄DNA 连接酶 ①对受体细胞无害； ②有一个至多个限制酶切割位点； ③有特殊的标记基因； ④能自我复制或能整合到宿主DNA上。 质粒、入噬菌体衍生物、动植物病毒 作为载体 的条件 载体 种类： 基因工程的基本工具 来 源 ： 主要来源于原核生物 小结 DNA 连 接 酶 限制酶 提示： 识别DNA 分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的 限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。 例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列 中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的 DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶 (目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。 练习与应用 1 、 C 2 、A 拓展应用 (2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有 什么意义 ? $$