2.2.1 动物细胞工程（第二课时）干细胞培养及应用 -2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修三

【资料】蝴蝶宝贝-大疱性表皮松解症（EB） 1 1 【资料】蝴蝶宝贝-大疱性表皮松解症（EB） 大疱性表皮松解症是一种罕见的遗传性皮肤病。 由于患者缺乏生成上皮细胞黏附蛋白的特定基因（LAMA3/LAMB3/LAMC2等），表皮未有效粘附到真皮上，轻微的冲击或摩擦（衣服、尿布、鞋子、手套等）都会使皮肤/黏膜表面形成水泡，就如同蝴蝶的翅翼一般脆弱。这种疾病被成为「最痛苦的绝症」。 当水泡破裂后，皮肤会裸露在外，变得难以愈合，感染的风险也较大。广泛的皮肤损伤会导致体液失衡和蛋白质消耗。粘膜受累可能引起营养不良、发育不良，呼吸障碍和泌尿生殖系统疾病。 2 2 【资料】蝴蝶宝贝-大疱性表皮松解症（EB） 通过细胞培养构建人造皮肤 将“人造皮肤”覆盖到患者全身 3 3 【资料】蝴蝶宝贝-大疱性表皮松解症（EB） ①取下患者一小块（邮票大小）正常皮肤（包括其中的干细胞） ②分散细胞 ③对其进行基因改造，转入正常 LAMB3 基因，以建立正常细胞系。（——基因工程） ④在体外进行细胞增殖，在水凝胶敷料上培育扩增后，获得正常表皮（接近1平方米）重新放置于患者身体各个皮损部位。（——动物细胞培养） 10天后，新的皮肤开始再生。八个月后，男孩皮肤的80％已经更新。不再一碰就出血，他恢复了正常的生活。 4 通过细胞培养构建人造皮肤 4 第2章第2节 动物细胞工程 动物细胞培养 动物细胞融合 动物细胞核移植 是动物细胞工程的基础 5 1. 概念： 一、动物细胞培养 2. 原理： 3. 培育的终点： 6 从动物体中取出相关的组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖的技术。 细胞增殖 细胞 动物细胞培养的条件 营养物质 其他条件 < < 糖类 氨基酸 无机盐 维生素 无菌、无毒的环境 适宜的温度、pH和渗透压 适宜的气体环境 7 二、动物细胞培养的条件 合成培养基 1.营养 葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物 血清 等 （将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配置而成的培养基） 液体培养基 （培养液） 含有多种未知的促细胞生长因子及其他活性物质，可以补充合成培养基中缺乏的物质 8 一般使用 二、动物细胞培养的条件 9 合成培养基：将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配置而成的培养基，如MEM培养基、RPMI-1640培养基、F12培养基 10 超净工作台 2. 无菌、无毒的环境 无菌 ①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理 ②在无菌环境下进行操作 定期更换培养液，以便清除代谢物 无毒 11 二、动物细胞培养的条件 3. 适宜的温度、pH和渗透压 哺乳动物多以（36.5±）℃ 温度： pH： 多数细胞生存的适宜pH在7.2-7.4 渗透压： 需要考虑的一个重要环境参数 4.气体环境 O2: 细胞代谢所必需的 CO2： 维持培养液的pH （95%空气和 5% CO2 ） CO2 培养箱 动物组织块 用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理 分散成单个细胞 制成细胞悬液 原代培养 问题 细胞分裂受阻 悬浮生长 贴壁生长 密度过大、有害代谢物积累和营养物质缺乏等 接触抑制 解决 传代培养 分瓶 12 三、动物细胞培养的过程 【思考1】选动物幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料的原因？ 因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。 13 三、动物细胞培养的过程 【思考2】用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理组织块，使组织块分散成单个细胞的目的是什么？ ①使细胞与培养液充分接触， 细胞所需的O2和营养物质容易供应， 其细胞代谢废物容易排出； ②使得在细胞水平操作的其它技术容易实现。 14 三、动物细胞培养的过程 【思考3】用胰蛋白酶分散细胞，由此可说明细胞间的物质主要是什么成分？ 【思考4】胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？那将动物组织分散成单个细胞时要注意什么问题呢？ 主要是蛋白质(胶原蛋白等)。 能，应注意时间的控制。因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质，长时间还会分解膜蛋白，对细胞造成损伤。 【思考5】能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？ 不能，因为动物细胞培养适宜的PH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。 15 三、动物细胞培养的过程 细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上。 培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于贴附。 培养皿 培养瓶 16 三、动物细胞培养的过程 瓶壁上的细胞层数是：一层（或单层） 贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。 接触抑制 分瓶培养 解除方法 癌变细胞没有接触抑制现象，可以在培养瓶中形成多层细胞 17 三、动物细胞培养的过程 将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养称为原代培养。 传代培养: 将分瓶后的细胞培养称为传代培养。 原代培养: - 在进行传代培养时，悬浮培养的细胞直接用离心法收集； - 贴壁细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。之后，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。 18 三、动物细胞培养的过程 19 【思考6】皮肤培养的过程中用胰蛋白酶处理了几次？目的是？ 第一次处理的目的是使组织细胞分散开； 第二次处理的目的是使细胞从瓶壁上脱离下来，便于分瓶后继续培养。 20 三、动物细胞培养的过程 1.幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较，分化程度低的细胞与分化程度高的细胞比较，哪些细胞更易于培养？为什么？ 细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物的细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物的细胞则相反。所以，一般来说，幼龄动物的细胞比老龄动物的细胞易于培养。同样，分化程度越低的细胞，増殖能力越强，所以更容易培养。 思考∙讨论 21 思考∙讨论 2. 动物细胞培养与植物组织培养有什么相同和不同之处？ 培养结果 动物血清 植物激素 常用液体培养基 常用固体培养基 培养基性质 细胞的全能性 原 理 动物细胞培养 植物组织培养 比较项目 新的细胞群，不形成个体 完整植株 培养基特有成分 细胞增殖 22 原代培养视频演示 23 传代培养视频演示 24 【资料1】蝴蝶宝贝-大疱性表皮松解症（EB） 大疱性表皮松解症是一种罕见的遗传性皮肤病。 由于患者缺乏生成上皮细胞黏附蛋白的特定基因（LAMA3/LAMB3/LAMC2等），表皮未有效粘附到真皮上，轻微的冲击或摩擦（衣服、尿布、鞋子、手套等）都会使皮肤/黏膜表面形成水泡，就如同蝴蝶的翅翼一般脆弱。这种疾病被成为「最痛苦的绝症」。 当水泡破裂后，皮肤会裸露在外，变得难以愈合，感染的风险也较大。广泛的皮肤损伤会导致体液失衡和蛋白质消耗。粘膜受累可能引起营养不良、发育不良，呼吸障碍和泌尿生殖系统疾病。 25 25 【资料1】蝴蝶宝贝-大疱性表皮松解症（EB） ①取下患者一小块（邮票大小）正常皮肤（包括其中的干细胞） ②分散细胞 ③对其进行基因改造，转入正常 LAMB3 基因，以建立正常细胞系。（——基因工程） ④在体外进行细胞培养，在水凝胶敷料上培育扩增后，获得正常表皮（接近1平方米）重新放置于患者身体各个皮损部位。（——动物细胞培养） 10天后，新的皮肤开始再生。八个月后，男孩皮肤的80％已经更新。不再一碰就出血，他恢复了正常的生活。 26 通过细胞培养构建人造皮肤 将“人造皮肤”覆盖到患者全身 26 表皮中被称为全克隆细胞（Holoclones，粉红色标记）的干细胞负责新皮肤的再生，而其他移植的角化细胞随时间消失。 这一发现提醒我们，干细胞是治疗的核心。 Hirsch, Tobias et al. “Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells.” Nature vol. 551,7680 (2017): 327-332. doi:10.1038/nature24487 【资料1】蝴蝶宝贝-大疱性表皮松解症（EB） 27 第2章第2节 动物细胞工程 一、动物细胞培养 第二课时 干细胞培养及其应用 28 1.来源： 2.特点： 一、什么是干细胞？ 来自于胚胎、胎儿或成人体内，存在于早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。 在一定条件下，具有无限制自我更新与增殖分化能力的一类细胞。 29 一、什么是干细胞？ 3.类型 概念 有无全能性 优势 局限性 胚胎干细胞（ES细胞） 成体干细胞 存在于早期胚胎中，具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。 是成体组织或器官内的干细胞，具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。 具有全能性 有一定分化潜能，不具有全能性 【任务一】阅读课本P46及补充资料【资料2】，小组合作完成表格，并讨论： ①干细胞的主要类型有哪些？ ②你认为哪一类干细胞更适用于医学领域呢？ ③这两种干细胞的优势和局限性分别体现在哪？ 成人体内的储量非常少、分离和鉴定非常困难、增殖分化能力有限等 必须从胚胎中获取，涉及伦理道德问题 每个人都有、成瘤性低、没有伦理争议，自身的成体干细胞没有免疫排斥 强大的自我更新和无限增殖的能力 30 胚胎干细胞 （ES细胞） 心肌细胞 神经细胞 造血干细胞 分化 分化 分化 体外培养 一、什么是干细胞？ 31 成体干细胞 造血干细胞 血细胞 神经系统中 神经干细胞 精原干细胞 神经细胞 精原细胞 骨髓、外周血和脐带血中 睾丸中 分化 分化 分化 一、什么是干细胞？ 32 干细胞有着自我更新能力及分化的潜能，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关，因而在医学上有着广泛的应用。 正常 干细胞 患者体内 受损的器官或组织 治愈疾病 修复或替换 移植 一、什么是干细胞？ 4.干细胞的应用 33 【资料3】 1945年，美国在日本广岛和长崎投下两颗原子弹后，造成大量伤亡，其中有很多都是辐射病，伤者骨髓抑制，失去了自我造血的能力，于是就有人尝试利用骨髓移植的方法来治疗这些病人。因为这些辐射已经摧毁了这些病人的免疫系统，所以得到了异乎寻常的成功。从此，骨髓移植开始成为了一项医学技术。 我国等待造血干细胞移植的患者有500万人，仅白血病患者每年就新增4万以上。 要成功地进行造血干细胞移植治疗，捐献者与患者之间的HLA(人类白细胞抗原)型别要相合。因此，必须建立中国人的造血干细胞捐献者资料库，并且是参加的志愿者越多，库容量越大，患者找到相合捐献者的机会就越多，“生机”就越多。 正常造血干细胞 患者体内 受损的血细胞 白血病 修复或替换 移植 造血系统、免疫系统功能障碍疾病 治疗 4.干细胞的应用 一、什么是干细胞？ 34 正常神经 干细胞 患者体内 受损的 神经组织 修复或替换 移植 治疗 神经组织损伤和神经退行性疾病 （帕金森病/阿尔茨海默） 一、什么是干细胞？ 4.干细胞的应用 【资料4】 2024年4月11日是第28个世界帕金森病日，帕金森病是一种常见于中老年人群的神经系统退行性疾病，有数据显示，我国约有300万帕金森病患者。 人脑的中脑部位的黑质神经元（DN）通过合成多巴胺，对大脑的运动功能进行调控。当这些黑质神经元变性死亡达80%以上时，就会出现帕金森病的症状。其症状表现为静止时手、头或嘴不自主地震颤，肌肉僵直、运动缓慢以及姿势平衡障碍等，导致生活不能自理。 35 胚胎干细胞必须从胚胎中获取，这涉及伦理问题，因而限制了它在医学上的应用。而成体干细胞也有它自身的局限性。 科学家们是如何解决这个问题的？ 36 【资料5】 2006年，日本科学家山中伸弥，从24个对胚胎干细胞维持十分重要的基因中筛选出4个基因组合（Oct4、Sox2、c-myc和KLF4），在小鼠的成纤维细胞中诱导表达，成功诱导出一种多能干细胞，称“诱导多能干细胞”（iPS细胞），并用iPS细胞治疗了小鼠的镰状细胞贫血。 2012年山中伸弥与约翰·戈登一起获得诺贝尔生理学奖或医学奖。 二、什么是诱导多能干细胞？ 37 1. iPS细胞的诱导流程 病人 各种类型的细胞 导入特定基因 导入特定蛋白 小分子化合物 成纤维细胞 T细胞 B细胞 iPS细胞 分化 取出 移植 二、什么是诱导多能干细胞？ 38 2.iPS细胞的应用优势 ①诱导过程无需破坏胚胎 ②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥。 所以，科学家普遍认为iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞。 取成纤维细胞等 转入相关因子 细胞发生转化 iPS细胞 分化 移植 二、什么是诱导多能干细胞？ 39 【任务二】 干细胞工程目前还面临着以下这些问题。请讨论： 未来我们还可以采取哪些措施解决这些问题？ 三、干细胞工程的未来？ ①基础理论研究和技术方面的问题：如维持干细胞未分化的机制，干细胞定向诱导分化的调控机制； ②生物安全问题：胚胎干细胞系是一个可以无限增殖的细胞系，这就有了成瘤性的风险； ③伦理问题：胚胎是否具有与人类等同的道德地位。 40 这些全能性的8细胞期胚胎样细胞重建了受精卵仅分裂3次后（受精卵发育3天）的胚胎状态。 相比诱导多能干细胞（受精卵发育5-6天的状态），这些细胞不仅可以分化成胎盘组织，而且有可能发育成更成熟的器官，还为体外研究早期胚胎发育的提供了重要工具。 2022年3月22日 Nature：重大突破！我国科学家领衔在世界上首次将人类多能性干细胞转化为8细胞阶段全能性胚胎样细胞 科技前瞻 41 现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。 （1）由于诱导iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施? 提示：像建立骨髓库一样，有研究团队正在尝试建立HLA多态性丰富的iPS细胞库，可以为需要的人找到HLA匹配度较高的iPS细胞，这样不仅可以节省时间、成本，还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。 （2）如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？ 提示：该技术可能被用于治疗不孕症；获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆研究；获得生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。 该技术可能带来一系列的伦理问题。例如，如果用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿；有的人还可能有目的地选择iPS细胞，从而“设计”婴儿。 练习与应用 二、拓展应用 42 Lavf58.29.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 Lavf57.71.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 Lavf58.51.100 Lavf58.51.100 $$