备课素材：DNA探针及其制备-2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3

DNA探针及其制备 先看一道试题： 制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（　　） A. ①②       B. ②③       C. ①④      D. ③④ 答案：D 这是2024年山东高考试题，考到了“DNA探针的制备”。教材没有详细介绍。 DNA探针（DNA probe）是最常用的核酸探针，为长度在几十到几百甚至上千碱基对的单链或双链DNA，用特殊示踪剂（如同位素、酶或有色基团）进行标记；在适当的pH值、温度和离子强度下，DNA探针利用分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，能与待测样本中互补的非标记单链DNA或RNA以氢键结合（杂交），形成双链复合物（杂交体）。杂交体的稳定性取决于两条单链核苷酸之间的互补程度。在严格的条件下（高pH值、高温、低离子强度），不完全匹配的杂交体的两链将会解离，而完全匹配的杂交体将保持双链。将未配对结合的探针洗去后，可用放射自显影或酶联反应等检测系统检测杂交反应结果。 DNA探针根据其来源分为3种：一种来源于基因组中的基因本身，称为基因组探针（genomic probe），可以是基因的全序列，或者基因上的一段序列；另一种是从相应的基因经转录获得mRNA，再通过逆转录得到的探针，称为cDNA探针（cDNA probe）；此外，还可在体外人工合成20～50个碱基的与基因序列互补的DNA片段，称为寡核苷酸探针。 据是否标记，DNA探针分为两类：同位素标记的探针和非同位素标记的探针。 同位素标记的探针通常有很高的放射比活性，杂交的灵敏度高，但使用期限短，且有放射性危害，污染物处置困难，需要特殊的仪器和设备，不适用于普通实验室。 近年来非同位素标记法得到很大发展，如酶促标记法（如生物素、地高辛标记法）和化学标记法（如荧光生物素、酶标记法）。非同位素标记的探针保存时间较长、避免了同位素的污染，但不及同位素标记探针敏感。 下面以同位素标记法为例介绍DNA探针的标记方法。 1．缺口平移法（nick translation） 缺口平移法是最常用的探针标记法，反应体系的主要成分有DNA酶I（DNase I）、大肠杆菌DNA聚合酶I（DNA polymerase I）、三种三磷酸脱氧核糖核苷酸、一种同位素标记的核苷酸（如dATP、dTTP、dCTP，”P—dGTP），其原理如图1。首先用适当浓度的DNA酶I在探针DNA双链分子上随机切开若干个缺口（不是切断DNA或将其降解），然后再借助于DNA聚合酶I的5 '→3'的外切酶活性，切去5’末端的核苷酸；同时又利用该酶的5’→3’聚合酶活性，使32P标记的互补核苷酸补入缺口．DNA聚合酶I的这两种活性的交替作用，使缺口不断向3’的方向移动，DNA链上的核苷酸不断为32P标记的核苷酸所取代。由于反应体系中含有同位素标记的单核苷酸，使新合成的链带有同位素标记，所以缺口平移实际上是同位素标记的核苷酸取代了原DNA链中不带同位素的同种核苷酸。 2.随机引物法（random primer） 随机引物法原理示意图 变性的探针溶液加入6个核苷酸的随机DNA小片段，作为引物，当后者与单链DNA多个部位互补结合后，按碱基互补原则不断在其3'-OH端添加同位素标记的单核苷酸，这样也可以获得放射性比活性很高的DNA探针。 3．末端标记法（end—labelling） 末端标记法原理示意图 末端标记法不是将DNA进行全长标记，只在其5'端或3’端导入标记物进行部分标记。该标记方法可得到全长DNA探针，因为携带的标记分子较少，所以标记比活性不高。 对任何DNA探针测定来说，杂交反应包括四个基本要素：探针、靶物质（样品中的待测核酸）、检验方法（根据采用的标记物或报告基因而定）和杂交模式。核酸分子杂交可分为液相杂交和固相杂交。 1．液相杂交 液相杂交是让DNA探针和待测核酸在溶液中进行反应。在溶液中，待测核酸和探针均自由运动，增加了两者结合的机会，因此液相杂交要比固相杂交快5～10倍。但液相杂交不易分离杂交体和游离核酸探针，常规应用不易。 2．固相杂交 固相杂交是先将待测核酸样本结合到固相载体上，再与溶于溶液中的检测杂交信号后分析杂交结果。 固相杂交的基本程序是：①准备待测样本；②制备和标记探针；③固相载体的处理；④预杂交、杂交、漂洗；⑤杂交信号检测；⑥结果判断及分析。 常用的固相杂交方法有斑点杂交法、夹心杂交法和原位杂交法等。下面简单介绍几种常用的核酸分子固相杂交方法。 ①斑点杂交法（dot blot hybridization）：最常用的杂交模式．将样品DNA直接点在硝酸纤维素膜或尼龙膜上，在严格的条件下杂交后进行检测。斑点杂交法简单、迅速，不需要限制性核酸内切酶消化DNA，也不需要凝胶电泳和转移，且在一张膜上可检测多个样品。该方法敏感性高，但对杂交条件控制不严可出现非特异性杂交。 ②夹心杂交法（sandwich hybridization）：采用位于待测基因两个相邻但不重叠的DNA序列制作探针，先将第一个不标记的探针（A探针，捕捉探针）吸附于固相支持物（如膜、孔或管）上，捕捉待测样本中与其互补的目标序列，然后加入第二个标记的探针（B探针，检测探针），与其互补序列结合后即可检测杂交信号。夹心杂交法的优点是特异性好，而且对核酸样品的纯度要求不高。 ③原位杂交法（in situ hybridization）：用核酸探针与组织或者细胞中的核酸进行杂交并对其进行检测的方法。先把待测组织或细胞固定到固相载体上，然后用适当去污剂和蛋白酶、酸等物质处理标本，使标记的核酸探针能进入细胞并与待测核酸形成杂交体，从而可直接检测到组织或细胞内的核酸序列。原位杂交法为细胞甚至亚细胞水平的核酸检测提供了直接的方法。 学科网（北京）股份有限公司 $$