专题18 基因工程-【好题汇编】5年（2020-2024）高考1年模拟生物真题分类汇编（山东专用）

专题18 基因工程 五年考情 考情分析 基因工程 2020年山东卷第5题 2020年山东卷第15题 2020年山东卷第25题 2021年山东卷第13题 2021年山东卷第25题 2022年山东卷第13题 2022年山东卷第25题 2023年山东卷第25题 2024年山东卷第13题 2024年山东卷第25题 通常以具体情境，考查基因工程的原理、工具和基本操作程序，启动子的含义和功能，PCR技术的原理，限制酶的作用、基因表达载体的组成、启动子的作用等，题目难度系数大；其中启动子的插入位点和插入方向、报告基因的表达等都需要学生有很强的理解信息、获取信息的能力、以及综合运用知识解决问题的科学思维和科学探究能力，通过基因工程考查学生的结构与功能观。 1、（2024山东高考） 关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A. 整个提取过程中可以不使用离心机 B. 研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C. 鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D. 仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 2、（2024山东高考） 研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 （1）用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越______（填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有______种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-______-3'和5'-______-3'。 （2）重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素______筛选到具有该抗生素抗性的植株①∶④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是______，其中纯合的突变植株是______（填序号）。 （3）实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为______，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 3、（2023山东高考） 科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 （1）与图甲中启动子结合的酶是____________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有________________（答出2个结构即可）。 （2）构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物___________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_____________（填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。 （3）重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了__________，条带2所检出的蛋白______________（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。 4、（2022山东高考） 关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（ ） A. 过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B. 离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C. 在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D. 粗提取的DNA中可能含有蛋白质 5、（2022山东高考） 某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。 （1）为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_______、为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______（填“3'端”或“5'端”）。 （2）PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是______。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是______。 （3）融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是______；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是______。 （4）根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是______。 6、（2020山东高考） 双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）与脱氧核苷三磷酸（dNTP）的结构如图所示。已知ddNTP按碱基互补配对的方式加到正在复制的子链中后，子链的延伸立即终止。某同学要通过PCR技术获得被32p标记且以碱基“C”为末端的、不同长度的子链DNA片段。在反应管中已经有单链模板、引物、DNA聚合酶和相应的缓冲液等，还需要加入下列哪些原料 ①dGTP，dATP，dTTP，dCTP ②dGTP，dATP，dTTP ③α位32p标记的ddCTP ④γ位32p标记的ddCTP A. ①③ B. ①④ C. ②③ D. ②④ 7、（2020山东高考） 研究人员用三种基因探针，通过分子杂交技术分别对某动物三种细胞中的mRNA进行检测，结果如下表所示。下列说法错误的是 细胞 杂交带 探针 输卵管细胞 未成熟红细胞 胰岛B细胞 卵清蛋白基因探针 有 无 无 β—珠蛋白基因探针 无 有 无 胰岛素基因探针 无 无 有 A. 三种探针的核苷酸序列不同 B. 有杂交带出现表明相应基因发生了转录 C. 用上述探针分别检测三种细胞的DNA，实验结果不变 D. 可用mRNA逆转录产生的DNA制作相应基因的探针 8、（2020山东高考） 基因定点整合可替换特定基因，该技术可用于单基因遗传病的治疗。苯丙酮尿症是由PKU基因突变引起的，将正常PKU基因定点整合到PKU基因突变的小鼠胚胎干细胞的染色体DNA上，替换突变基因，可用来研究该病的基因治疗过程。定点整合的过程是：从染色体DNA上突变PKU基因两侧各选择一段DNA序列HB1和HB2，根据其碱基序列分别合成HB1和HB2，再将两者分别与基因、连接，中间插入正常PKU基因和标记基因，构建出如图所示的重组载体。重组载体和染色体DNA中的HB1和HB2序列发生交换，导致两者之间区域发生互换，如图所示。 （1）构建重组载体时，常用的工具酶有________。该实验用小鼠胚胎干细胞作为PKU基因的受体细胞以培育出转基因小鼠，除了胚胎干细胞能大量增殖外，还因为胚胎干细胞_________。 （2）为获得小鼠的胚胎干细胞，可将小鼠囊胚中的_________取出，并用_________处理使其分散成单个细胞进行培养，培养过程中大部分细胞会贴附在培养瓶的表面生长，这种现象称为___________。 （3）用图中重组载体转化胚胎干细胞时，会出现PKU基因错误整合。错误整合时，载体的两个中至少会有一个与一起整合到染色体DNA上。已知含有的细胞具有G418的抗性，、的产物都能把DHPG转化成有毒物质而使细胞死亡。转化后的胚胎干细胞依次在含有G418及同时含有G418和DHPG的培养液中进行培养，在双重选择下存活下来的是__________的胚胎干细胞，理由是_________。 （4）将筛选得到的胚胎干细胞培育成小鼠，从个体生物学水平检测，若小鼠__________，说明PKU基因成功表达。 9、（2021山东高考） 粗提取 DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（ ） A. 加入适量的木瓜蛋白酶 B. 37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟 C. 加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精 D. 加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L 10、（2021山东高考） 人类γ基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。 （1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是____，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是_____。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要____种酶。 （2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是____。 （3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于_____，理由是___。 一、单选题 1．（2024·山东德州·二模）DNA分子的碱基具有吸收260nm波长光的特性。当DNA两条链碱基紧密连接时，吸光度偏低；两条链分离时，吸光度升高，因此DNA变性可通过DNA溶液对260nm波长光的吸光度来检测。肺炎链球菌DNA的变性曲线如图所示，吸光度达到最大值的50%时的温度称为熔解温度（Tm）。下列说法正确的是（　　） A．加热会破坏脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键使DNA变性 B．A、T碱基对所占比例越高的DNA，变性曲线中Tm值越高 C．加热至约70℃时DNA两条链从一端向另一端逐渐分离 D．利用PCR技术检测目的基因时需要先将DNA变性 2．（2024·山东威海·二模）ω-3多不饱和脂肪酸（LCPUFA）有预防心血管疾病的作用，但大多数动物体内不能合成。科研人员利用转染技术（将外源DNA转入受体细胞的技术）将LCPUFA—合成酶基因（fat-1基因，含1229bp）导入小鼠受精卵，培育出转基因小鼠，基本流程如下图甲所示。图乙表示提取不同实验组别小鼠受精卵DNA后，利用fat-1基因的引物进行PCR扩增后电泳的结果。下列说法错误的是（    ） A．采用农杆菌转化法可确保图甲中转染的效果 B．PCR扩增3轮后，只含一种引物的DNA分子的比例为1/4 C．由图乙可知，只有2组转染成功 D．若fat-l基因单点插入，则转基因小鼠相互交配产生的大多数后代体内能合成LCPUFA 3．（2024·山东·二模）由于PCR扩增出的目的基因末端为平末端，且无合适的限制酶识别序列，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。下图为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列，下列叙述正确的是（    ）    A．构建重组载体P时，应选择EcoRV进行酶切，再用T4DNA连接酶连接 B．为了便于该目的基因接入载体E，可用限制酶EcoRV或SmaI切割载体P C．载体P不能作为基因表达载体，是因为它不含起始密码子和终止密码子 D．若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，表明重组载体成功导入受体细胞 4．（2024·山东·模拟预测）研究人员用酶和酶两种限制酶同时处理某DNA分子和质粒，得到的DNA片段如图所示。图中DNA片段只注明了黏性末端处的碱基种类，其他碱基的种类未注明。下列叙述错误的是（    ） A．该DNA分子和质粒上均含有酶的一个切割位点和酶的一个切割位点 B．根据图示信息不能确定图中形成的不同黏性末端与这两种限制酶的对应关系 C．用T4D NA连接酶或E.coli DNA连接酶均可以将片段乙和片段丁连接起来 D．片段乙、片段丁、片段戊可依次连接形成一个环状DNA分子 5．（2024·山东淄博·二模）dNTP（包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP）的结构与ATP类似，除碱基不同外，dNTP含有脱氧核糖。与dNTP相比，ddNTP的五碳糖为双脱氧核糖，其3'碳位为-H且不能与磷酸形成化学键。现有甲~丁四个PCR反应体系，甲体系中含有放射性磷标记的ddATP（记作ddATP+）和DNA模板链。PCR完成后，经电泳（分子量小的DNA在电场中移动快）将甲体系中一组长度不等的DNA单链分离。丙、乙、丁三个PCR体系与甲相似，分别用于检测T、C、G的碱基序列，检测结果如图。下列说法正确的是（    ） A．ddATP+中的放射性磷酸基团应位于ddATP的末端 B．甲体系中除含ddATP+外，还应含有dTTP、dGTP、dCTP C．新掺入脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接在子链的5'端 D．模板DNA的碱基序列为3'CTGGACTGACAT5' 6．（2024·山东济宁·三模）变性梯度凝胶电泳（DGGE）是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链程度的不同，导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。当DNA片段泳动到某一浓度的变性剂位置时，DNA发生解旋变性，导致电泳迁移率下降，最终会停留在某一位置。下列说法正确的是（    ） A．提高电泳的温度有利于提高分离效率 B．DGGE技术可用于基因突变检测及相关研究 C．DNA中的A、T碱基含量越高越不容易发生变性 D．电泳时需将待测DNA与电泳缓冲液混合后注入加样孔内 7．（2024·山东·模拟预测）天然β-淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明显提升。我国学者借助PCR改造β-淀粉酶基因（如图，①~④表示引物片段），并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。下列相关叙述正确的是（    ）    A．PCR中使用的聚合酶属于以RNA为模板的DNA聚合酶 B．由图可知，β-淀粉酶基因改造方案中需用到引物①和④ C．改造后的基因应该插入pLN23质粒的起始密码子的下游 D．利用PCR在分子水平上确定目的基因是否转录需用到逆转录酶 8．（2024·山东潍坊·二模）从大肠杆菌中提取某条mRNA逆转录形成一条cDNA单链并测序，测得该序列为5'-⋯CGTAGC，⋯-3'。现将该序列形成双链，构建表达载体并导入细胞中表达形成肽链。反密码子与对应的氨基酸关系如下表所示。下列说法错误的是（    ） 反密码子（方向为3'到5'） CGA CGU UGC ACG AGC GCU 氨基酸 丙氨酸 丙氨酸 苏氨酸 半胱氨酸 丝氨酸 精氨酸 A．5'-GCU-3'和5'-GCA-3'是编码丙氨酸的密码子 B．编码该mRNA的DNA序列的模板链与该cDNA单链序列相同 C．构建表达载体时该cDNA单链的3'端与启动子相连 D．该细胞表达的多肽序列为“⋯-丙氨酸-半胱氨酸-⋯” 9．（2024·山东济南·三模）临床上可采用PCR 和DNA反向点杂交相结合的检测技术对HPV基因进行分型，过程如下：设计出针对已知有致癌风险的23种HPV基因的特异性引物并标记上会发生显色反应的生物素，通过 PCR 对待测样本 DNA 进行扩增，再将扩增产物直接与固定在膜上的分型基因探针（包括17种高危型和6种低危型）进行杂交。经显色处理后，与固定化探针结合的HPV基因就会在相应位置产生显色反应，从而判断待测样本是否被含有这些 HPV基因的病毒感染。有关说法错误的是（　　） A．生物素应标记在引物的5’端 B．该检测技术需要对扩增的DNA样本进行琼脂糖凝胶电泳 C．该检测技术具有高度的特异性，能够准确地区分不同类型的HPV 病毒 D．反向点杂交是通过分型基因探针与扩增的目的片段碱基互补配对结合在一起的 10．（2024·山东滨州·二模）染色体DNA复制时需要一小段RNA作为引物，这是因为DNA聚合酶只能从引物的3'端连接脱氧核苷酸。复制时两条子链的延伸方向相反，其中一条子链称为前导链，该链连续延伸，另一条称为后随链，该链逐段延伸，这些片段称为冈崎片段，如图1所示。图2表示图1中一段RNA引物去除并修复的过程。下列说法错误的是（　　） A．酶1可以切除RNA片段，但不能切除与脱氧核苷酸连接的核糖核苷酸 B．染色体DNA复制需要RNA聚合酶、DNA连接酶的参与 C．每个冈崎片段的形成和其引物去除并修复的过程需两次DNA聚合酶的催化 D．染色体DNA复制结束并切除所有引物后形成的两个子代DNA分子碱基序列完全相同 11．（2024·山东泰安·二模）稻米胚乳直链淀粉含量高会导致食用品质差。研究发现，水稻蜡质基因（Wx）编码直链淀粉合成酶。若Wx基因中第226位碱基是正常的G，该位点所在内含子能被正常剪接，胚乳中直链淀粉含量最高，基因型记做GG；若该位点突变成T，则不能被正常剪接，胚乳中直链淀粉合成水平会降低，基因型记做TT。为检测Wx基因该位点碱基是G或T，研究人员以待测水稻叶片总DNA为材料，以Wx基因片段设计引物如图所示，对PCR扩增产物经AccⅠ酶切后电泳。已知引物1为5'-GCTTCACTTCTCTGCTTGTG-3'，两引物之间无另外的AccⅠ酶的识别位点。下列说法正确的是（    ） A．该实验中需设计的引物2为5'-TTCAACTCTCGTTAAATCAT-3' B．若酶切产物只能观察到450bp的DNA条带，则表明该水稻品种为TT型 C．GT杂合型水稻品种酶切电泳结果为3条条带 D．组成上述两种淀粉合成酶的氨基酸种类不同，数目相同 12．（2024·山东·二模）可利用基因芯片技术检测棉花基因在胚珠和纤维组织中的表达情况，基因芯片的制作和检测流程如下；将棉花基因组中的各基因分别进行PCR扩增→再将各基因扩增产物按一定顺序点在玻璃板上的相应位置，变性、固定→分别从棉花胚珠和纤维中分离总mRNA，反转录生成cDNA→将两种cDNA分别用绿色和红色荧光染料标记→将标记后的cDNA与基因芯片杂交→进行荧光检测（若绿色和红色叠加则呈现黄色）。下列说法错误的是（    ） A．逆转录过程与芯片杂交过程的碱基互补配对方式相同 B．若芯片上某基因处的红色荧光较强，说明该基因在棉花纤维组织中表达水平较高 C．若芯片上某基因处显示黄色，可能是由于该基因在两种组织中均表达 D．若某基因处只出现红色或绿色，该基因可能是组织特异性表达的基因 13．（2024·山东日照·二模）反向PCR是利用已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图。下列叙述错误的是（    ） A．过程①可用同种限制酶切割磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键 B．过程②需用DNA连接酶将酶切片段环化以实现对未知序列的扩增 C．过程③需添加方向相对的引物1和3以便DNA聚合酶从其3′端延伸子链 D．过程③中将温度调至72℃的目的是使引物与模板链通过碱基互补配对结合 14．（2024·山东济宁·二模）关于“DNA粗提取和鉴定”以及“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法错误的是（　　） A．将洋葱研磨液离心是为了加速杂质的沉淀 B．根据DNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同，可去除部分杂质 C．DNA分子在电场作用下可以带上正电荷或负电荷 D．PCR实验中使用的微量离心管和枪头在使用前需进行高压灭菌处理 15．（2024·山东枣庄·二模）DNA的双链中，转录时作为模板功能的链叫作反义链，另一条叫作有义链。下图是DNA分子中某些基因有义链和反义链示意图。下列说法错误的是（　　） A．根据启动子和终止子的相对位置可以判断哪条链作为反义链 B．不同的基因可能同时复制，也可能同时转录 C．DNA分子的一条链对不同基因来说，有的是有义链，有的是反义链 D．基因的转录和翻译都是沿着模板的3'端到5'端进行的 二、多选题 16．（2024·山东青岛·三模）科学家将某病毒抗原蛋白的部分编码序列（RBD）拼接成融合基因2RBD和3RBD，探究RBD的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟RBD的天然构象并获得高效免疫原性。为鉴定重组质粒是否构建成功，将重组质粒用Nco I和Sac I双酶切处理后电泳，结果如图，其中泳道1为双酶切pNZ8149-2RBD，两个条带大小分别为2507bp和2020bp。将构建好的重组质粒分别导入工程菌中进行表达产物的检测。下列说法正确的是（    ） A．PCR扩增融合基因时，在引物的3'端添加相应限制酶的识别序列 B．据图可知，融合基因3RBD的长度为2686bp C．泳道2呈现一个条带的原因是酶切pNZ8149-3RBD后产生的两个片段大小相近 D．从工程菌细胞表面提取蛋白质进行检测，从而进一步比较两者的免疫原性 17．（2024·山东临沂·二模）丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）引起的一种传染病。为研制针对HCV的多肽疫苗，某研究小组构建LTB-R9-Bp融合基因的过程如图，进而构建出融合基因表达载体，其中LTB是一种免疫增强剂基因，R9-Bp是HCV两个相连的包膜蛋白基因。下列说法正确的是（    ） A．PCR反应体系中需加入待扩增的模板、引物、原料以及耐高温的DNA聚合酶 B．若要大量扩增LTB-R9-Bp融合基因，可选择引物P2和引物P3继续进行PCR C．融合基因表达载体的组成元件有融合基因、标记基因、启动子和终止密码子等 D．若利用转基因植物生产该疫苗，需用到基因工程、植物组织培养和抗原抗体杂交技术 18．（2024·山东青岛·二模）TaIBH1-2D是小麦中一个调控千粒重的关键基因。为验证TaIBHI-2D的功能，研究人员构建了过表达株系，可利用酶切法检验TaIBH1-2D与载体是否连接，图1三个泳道分别是用不同的限制酶完全酶切后（只考虑图示酶切位点），产物经琼脂糖凝胶电泳的结果；同时构建了敲除TaIBH1-2D基因的突变体。图2统计了不同植株的千粒重。下列说法正确的是（    ） A．电泳的缓冲液中含指示剂，可在紫外灯下被检测出来 B．泳道1为单酶切空载体，泳道2为单酶切的重组载体 C．泳道3为双酶切的重组载体，且目的基因与载体正确连接 D．由图2分析，TaIBH1-2D负调控小麦千粒重 19．（2024·山东泰安·模拟预测）为使玉米获得抗除草剂性状，科研人员进行了相关操作(如图所示)。含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达，其正确表达产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列叙述错误的是（    ）        A．T-DNA可将基因G转移并整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上 B．利用物质K和抗生素进行筛选1，可获得农杆菌的蓝色菌落 C．利用物质K和除草剂进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株 D．提高培养基中细胞分裂素和生长素的比值，有利于诱导生根 20．（2024·山东·模拟预测）科学家发现一种名为Tat-SIRT5-CTM的细胞穿透肽，其可以抑制小胶质细胞中炎症细胞因子的表达，使神经元免受损伤。研究者欲通过基因工程来生产Tat-SIRT5-CTM，如图是采用PCR技术检测目的基因插入染色体的位置的流程图。下列说法正确的是（　　） A．Tat-SIRT5-CTM可防止某些疾病造成脑损伤 B．可利用抗原—抗体杂交技术检测穿透肽的表达量 C．转基因技术中目的基因插入染色体的位点通常具有确定性 D．Ⅰ过程不能利用不同的限制酶切割，来构建图中的环状DNA 三、非选择题 21．（2024·山东青岛·三模）乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因（LDH）插入酿酒酵母表达载体pAUR123（图1）中，经过转化、筛选、鉴定和培养，获得了产乳酸的商用酿酒酵母菌。 (1)研究者将LDH基因编码序列中的同义密码子（一种氨基酸有两种或者两种以上的遗传密码子）替换为酿酒酵母偏好的密码子，替换的目的是 。再通过 法将核苷酸按照顺序一个一个连接起来，由此获得少量的LDH。 (2)图2所示LDH的部分序列和相应限制酶识别序列，AUG为真核生物偏好的起始密码子，利用E．coliDNA连接酶将LDH正确插入pAUR123载体时，应分别选择 、 对目的基因和载体进行酶切处理。 (3)将得到的重组pAUR123表达载体，转入经 处理的大肠杆菌，接种于液体培养基中进行培养，其目的是 。再将重组表达载体和不能合成尿嘧啶的酿酒酵母细胞悬液混合，转化后的细胞稀释涂布于不含尿嘧啶的培养基中进行筛选，据此推测，pAUR123上的标记基因为 。 (4)通过 技术检测酿酒酵母菌株中是否转录出LDH的mRNA。欲对转LDH基因酿酒酵母发酵产乳酸能力进行检测，其实验思路是 。 22．（2024·山东菏泽·一模）酵母是一种能够引发有机源或者动物源物质发酵的真菌，它有许多分类，其中酿酒酵母是知名度最高，也是与人类关系最广泛的一种酵母。我国是世界上啤酒生产和消费大国，啤酒是以大麦为主要原料经酵母发酵制成的。请回答下列问题： (1)为了制备啤酒酵母分离培养基，实验人员将马铃薯去皮切块后高压煮沸，过滤后补加蒸馏水至1L，加入葡萄糖和琼脂后加热融化。将马铃薯高压煮沸的目的是 ，该培养基的碳源主要包括 ，用于装培养基的培养皿一般用 法进行灭菌处理。 (2)啤酒在工业化生产过程中，发酵过程分为 两个阶段。第一阶段结束后，发酵液在 的环境下储存一段时间进行第二阶段，形成澄清、成熟的啤酒。 (3)下图所示为用酿酒酵母生产乙肝疫苗的过程图，回答相关问题： ①研究人员拟用PCR扩增目的基因片段，已知目的基因的一条链为5'—ATTCCATATC……CCATGCC—3'。在PCR反应体系中需加入缓冲液、引物、4种脱氧核苷酸、含目的基因的DNA模板以及 。设计了一条引物为5'—GGCATG—3'，另一条引物为 （写出6个碱基即可）。 ②要形成有效的重组质粒，选择适当的限制酶很重要，根据图乙和图丙可知，选择 最佳，原因是 。 ③在添加卡那霉素和四环素的培养基中有少量菌落，说明了 。 23．（2024·山东菏泽·二模）由P基因编码的P蛋白是一种水通道蛋白，该蛋白在植物调节水分吸收方面发挥着重要作用。科研人员成功培育出超量表达P蛋白的转基因玉米。培育过程中所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图1所示。 (1)构建基因表达载体时，切割Ti质粒应选用 酶。从切割DNA片段和Ti质粒到构建基因表达载体完成共需 种酶。 (2)将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入 （填“潮霉素”、“卡那霉素”或“潮霉素或卡那霉素”）进行筛选，理由是 。筛选出的愈伤组织最终培养成转基因玉米。 (3)农杆菌转化法除了用于获取转基因植物外，还可以通过T-DNA插入基因内部使基因沉默，获得突变体。为了获得mm突变体，某科研小组利用野生型MM，通过农杆菌转化法使基因M沉默。由于T-DNA插入的位置是随机的，为确定T-DNA是否插入M基因中，该小组采用“三引物法”进行PCR扩增，即采用三种引物（LP、RP、BP），LP、RP为与目的基因片段互补的特异引物，BP为插入T-DNA的特异引物，如图所示。（说明：T-DNA插入基因后，会阻止被插入基因两端引物的扩增产物的形成）根据下表中三种样品的电泳结果判断样品 是纯合突变体，理由是 。 引物种类样品序号 LP+RP BP+RP 样品1 有大片段 无 样品2 有大片段 有小片段 样品3 无 有小片段 24．（2024·山东临沂·二模）滚环扩增技术（RCA）是借鉴自然界中病原生物体环状DNA分子滚环式复制方式发展起来的一种核酸扩增方法，在致病菌、核酸肿瘤标记物、蛋白质、生物小分子和病毒检测领域有着广泛应用。图1为RCA原理示意图。具核梭杆菌为一种强粘附性消化道细菌，侵入肠黏膜后可诱导局部炎症和细胞因子的表达增加，导致结直肠肿瘤的形成。科研人员采用基于RCA的荧光标记滚环扩增检测方法，实现了在微量样品及复杂环境下的高灵敏度、高特异性的检测。图2为荧光标记滚环扩增检测过程示意图，过程②是使锁式探针环化的过程。其中nusG基因为具核梭杆菌的特异性基因，锁式探针为依据nusG基因序列设计出来的单链DNA分子，由两端的检测臂和无关序列组成。只有当环境中存在靶核酸序列时，锁式探针才能完成成环连接反应。检测探针中的荧光基团（FAM）距离淬灭基团（BHQ-1）比较近时，荧光会被淬灭。    (1)由图1推测，Phi29DNA聚合酶的作用是 。与常规PCR相比，RCA缺乏 环节，因此可推测RCA扩增过程中使用的Phi29DNA聚合酶不具有 的特性。 (2)过程②锁式探针完成成环连接反应需要 的催化。肠道中含有多种微生物，为保证检测的特异性，在设计锁式探针时需保证 ，同时还需注意无关序列中不含 。 (3)若检测样品存在具核梭杆菌，检测探针中荧光基团发出荧光的原理是 。该检测方法具有高灵敏度的原因是 。 25．（2024·山东济宁·三模）PCR技术的实用性和极强的生命力其使成为生物科学研究的一种重要方法，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。下面是两个具体实验中的PCR技术应用，请根据资料回答下列问题： (1)重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。利用该技术可以实现基因的定点诱变。它在需要诱变的位置合成两个带有变异基因碱基的互补引物，然后分别与引物a和引物d做PCR，这样得到的两个PCR引物产物都带有变异基因，并且彼此重叠，再将重叠部位进行重组PCR就能得到诱变PCR产物，如图所示： ①PCR扩增DNA的过程中，引物a、b、c、d中，PCRI应选择图1中引物 ，大量扩增突变产物AD则应选择引物 。 ②重叠延伸PCR通过 实现定点突变。PCR1和PCR2需要分别进行的原因是 。 ③若正常基因可被限制酶DpnI识别并切割，特定位点突变后的基因不能被DpnI识别，请设计实验思路鉴定上述过程获得的突变产物AD是否为突变基因： 。 (2)反向PCR可用于扩增未知序列，其原理如下图所示。下图链状DNA分子内侧是已知序列，外侧为未知序列。 ①不直接在图2中DNA分子的两端设计引物并进行扩增，原因是 。 ②图3中环状DNA进行PCR的过程中，沿引物A延伸子链的延伸方向是 （填“顺时针”或“逆时针”），PCR产物 （填“含有”或“不含”）EcoRI的酶切位点。 26．（2024·山东济南·模拟预测）雄性不育植株可简化育种流程，是杂交育种的重要材料。研究发现利用油菜纯合的雄性不育植株甲做母本与野生型杂交，后代均可育，但总会出现部分白化幼苗长到成体死亡。为研究相关机制，提高育种效率，科研人员进行了相关实验。 (1)植株甲中存在雄性不育基因A’，导致雄蕊不能发育。实验发现甲与油菜品系丙杂交，后代均可育，且不出现白化现象。科研人员将甲与野生型杂交所得存活的F1与甲、丙杂交得到的F1杂交，发现子代中雄性可育幼苗占比为 ，进而推测丙产生了新的显性突变基因(记作B)，使雄性不育基因A’导致的不育性状得以恢复，且两基因位于非同源染色体上。 (2)为研究A’、B基因与白化性状的关系，科研人员进行如下实验。 ①从油菜中分离A’、B基因，将A'基因导入拟南芥(拟南芥不含与A’、B同源的基因)，筛选得到至少插入一个外源基因的转基因植株TA群体。将B基因转入拟南芥，经筛选获得纯合子TB．设计杂交实验，检测存活F1的基因组成，杂交组合及结果如下表。 组号 杂交组合 存活的F1 成体总数 含A’成体数 不含A’成体数 一 ♀TA群体×♂野生 630 95 535 二 ♀TA群体×♂TB 607 415 192 据实验结果推测，A’基因引起部分子代死亡，B基因可抑制A’基因的作用，依据是 。二组F1中含有A’的植株比例超过1/2的原因 。 ②植物中核蛋白N与叶绿体发育有关。新的研究发现，基因A’的表达产物可与核蛋白N形成复合体。科研人员推测，基因B通过抑制A’基因的表达而解除A’对N的影响。为证明该推测，请完成下列实验设计。 实验材料 操作 观察指标 野生型拟南芥 导入A’基因 叶绿体发育情况 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ a.导入A’基因   b.导入B基因   c.导入A’、B基因   d.野生型拟南芥   e.N缺失突变拟南芥 观察指标Ⅰ～Ⅳ应依次填写 (填写选项前字母)。 (3)B基因突变如下图1所示： 为了检测某个体基因型，研究人员拟用PCR扩增该基因，再用某限制酶(识别序列及切割位点如图2所示)完全酶切。设计了一条引物为5’-GGCATG-3’，另一条引物为 (写出6个碱基即可)。用上述引物扩增基因片段后，其酶切产物长度可能为 bp(注：该酶切位点在目的基因片段中唯一)。再对酶切产物通过 的方法检测，可以确定该个体基因型。 27．（2024·山东德州·二模）抗菌肽是一类广泛存在于自然界中的多肽，对细菌、真菌、寄生虫和病毒具有广泛的抑制作用。科研人员将抗菌肽Piscidin基因及NK-lysin基因进行融合形成杂合肽NK-LPd基因（部分过程如图1所示），从而获得具有更高抗菌活性的杂合抗菌肽。   (1)DNA聚合酶能够从引物的 （填“3´”或“5´”）端开始连接脱氧核苷酸。若设计的引物较长，为提高PCR的准确度需要适当 （填“提高”或“降低”）复性温度。 (2)Piscidin基因表达以a链为模板，NK-lysin基因表达以d链为模板。为了实现图1中两基因重叠延伸，PCR1过程中需要分别在引物 和引物 的5´端添加互补序列。 (3)图2为PCR1扩增产物（Ⅰ、Ⅱ）和PCR2扩增产物（Ⅲ）的凝胶电泳实验结果，根据结果可说明基因融合成功，判断依据是 。   (4)在转化前，需要先构建含NK-LPd基因的表达载体，其目的是 ；在成功转化的酵母菌中提纯得到杂合抗菌肽NK-LPd，为验证NK-LPd对大肠杆菌的抑菌效果，先将大肠杆菌涂布在图3的平板上，再放置滤纸片。根据图示实验结果推测，在A、D区域放置的滤纸片分别为 。   28．（2024·山东青岛·二模）某种雄性不育水稻是由野生型水稻的核基因M突变为m所致，科研团队构建转基因智能不育系的思路是：将育性恢复基因OsNP1（在原始生殖细胞中表达）、花粉失活基因ZM-AA（在花粉中表达）两个基因一起构建重组Ti质粒。然后通过农杆菌转化法将目的基因导入愈伤组织细胞，从转基因后代中筛选m位点是纯合的但是两个转基因位点是杂合的可育植株。 (1)图1为已导入ZM-AA基因的重组Ti质粒，图2为OsNP1基因和相应的酶切位点，其中A链为转录模板链。为使OsNP1基因与图1中Ti质粒正确连接来构建基因表达载体，应选择的酶有 ；采用PCR技术扩增图2中的OsNP1基因时，会出现长、中、短三种长度的单链，一个OsNP1基因在第n次循环中新合成的短链数为 。 (2)重组Ti质粒中的新霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因的具体作用分别是 、 。 (3)若使两个基因分别在不同的细胞中表达，需将两个基因分别与 重组在一起。 (4)在不考虑其他变异的情况下，筛选出的杂合体转基因植株自交后代会出现 种基因型。从转基因安全性的角度分析，构建此转基因智能不育系的优点是 。 29．（2024·山东威海·二模）营养期杀虫蛋白（Vip3Aa）是苏云金芽孢杆菌在营养生长阶段产生的一种新型杀虫蛋白，对许多鳞翅目害虫具有较强的杀虫活性。研究人员以鳞翅目害虫草地贪夜蛾为模型，筛选获得了与Vip3Aa抗性相关的基因（Sfmyb基因）。 (1)研究人员首先采用RNA干扰（RNAi）技术使草地贪夜蛾体内部分Sfmyb基因沉默，发现幼虫对Vip3Aa的敏感性显著降低，由此说明Sfmyb基因与Vip3Aa抗性的关系是 。 (2)研究人员通过启动子活性实验发现草地贪夜蛾抗性品系中Sfmyb基因启动子的活性低于敏感品系。由此推测，Vip3Aa抗性的产生可能是由于Sfmyb基因启动子活性下调后影响 ，从而改变了Sfmyb基因的转录水平。进一步研究发现，抗性品系中Sfmyb基因启动子发生了多个位点的突变和缺失。与敏感品系相比，抗性品系中Sfmyb基因控制合成的蛋白质的氨基酸序列 （填“发生”或“不发生”）改变，原因是 。 (3)进一步研究发现，Sfmyb基因的表达产物转录因子myb（能识别特定DNA序列并与之结合）可调控下游祀标基因的农达水平从而导致抗性性状的出现。研究人员采用反向酵母单杂交技术对某待测基因是否是myb的靶标基因进行鉴定，具体操作步骤为： ①采用PCR技术扩增待测基因，再将待测基因插入下图结构N所示的启动子上游，构建基因表达载体1，将Ⅰ导入营养缺陷型酵母菌中。 ②将Sfmyb基因和AD基因（能表达出转录激活蛋白AD）融合后构建基因表达载体Ⅱ.将其转入上述转基因酵母菌中，融合基因表达出的转录因子myb和AD组合成复合蛋白，当myb能识别待测基因并与之结合时，AD便发挥转录激活活性，诱导下游组氨酸合成基因和色氨酸合成基因表达。 ③将上述转基因酵母菌接种到特定的固体培养基上培养，观察是否有菌落产生。 步骤①中，PCR扩增待测基因时加入的引物需满足的条件是 ；为确定结构N中待测基因插入方向正确，采用PCR技术检测时，应选择上图中的引物 。步骤③中。特定的固体培养基是指 ；若观察到培养基中有酵母菌菌落分布，则说明 ，得出上述结论的依据是 。 30．（2024·山东烟台·三模）研究人员拟培育转fat1基因和fat2基因的转双基因猪，为避免fat1蛋白和fat2蛋白相互融合影响功能，利用重叠延伸PCR技术在fat1基因和fat2基因之间插入具有自剪切功能的2A连接肽基因，构建fatl-2A-fat2融合基因。2A基因的转录产物可通过“核糖体跳跃”断开位于2A肽尾端甘氨酸（G）和脯氨酸（P）之间的肽键，将2A基因编码的蛋白分割成2个独立蛋白。图甲表示利用重叠延伸PCR技术成功构建融合基因的过程。图乙表示构建成功的包含融合基因的重组质粒的部分片段，F1～F4、R1～R4表示引物。    (1)利用PCR技术可实现在体外快速大量扩增DNA，其与细胞内DNA复制的共同点是 （答出2点）。若图乙中融合基因的b链为模板链，则图甲PCR1中的引物甲与图乙中的引物 的绝大部分序列相同。 (2)PCR1和PCR2需要分开单独进行，原因是 。PCR3不需要引物，高温加热后fat1—2A和2A—fat2的双链解开，其中能正常延伸形成融合基因的是 （填序号）形成的杂交链。 (3)图乙构建的重组质粒中未标注出的必需元件还有 。为确定fat1基因连接到重组质粒中且插入2A序列的上游，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图乙中的引物 。所融合基因经下图中的过程表达产生fat1和fat2两种蛋白，经检测发现通过该技术表达的fat1蛋白较正常fat1蛋白的分子量大，据该融合基因的结构和表达原理推测，原因是 。    原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！2 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题18 基因工程 五年考情 考情分析 基因工程 2020年山东卷第5题 2020年山东卷第15题 2020年山东卷第25题 2021年山东卷第13题 2021年山东卷第25题 2022年山东卷第13题 2022年山东卷第25题 2023年山东卷第25题 2024年山东卷第13题 2024年山东卷第25题 通常以具体情境，考查基因工程的原理、工具和基本操作程序，启动子的含义和功能，PCR技术的原理，限制酶的作用、基因表达载体的组成、启动子的作用等，题目难度系数大；其中启动子的插入位点和插入方向、报告基因的表达等都需要学生有很强的理解信息、获取信息的能力、以及综合运用知识解决问题的科学思维和科学探究能力，通过基因工程考查学生的结构与功能观。 1、（2024山东高考） 关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A. 整个提取过程中可以不使用离心机 B. 研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C. 鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D. 仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 【答案】A 【解析】 【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是： ①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同 浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可 以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出， 从而达到分离的目的; ②DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离; ③在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。 【详解】A、在DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正确； B、研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误； C、鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误； D、加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。 故选A。 2、（2024山东高考） 研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 （1）用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越______（填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有______种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-______-3'和5'-______-3'。 （2）重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素______筛选到具有该抗生素抗性的植株①∶④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是______，其中纯合的突变植株是______（填序号）。 （3）实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为______，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 【答案】（1） ①. 低 ②. 4 ③. GTTT ④. AAAC （2） ①. 卡那霉素 ②. Sac Ⅰ ③. ④ （3）1/4 【解析】 【分析】1、基因工程的基本操作程序包括目的基因的筛选与获取，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。 2、PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术，利用PCR可以快速的获取和扩增目的基因。 【小问1详解】 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。由此可知，在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，由图可知该序列中有两个该酶切位点，因此最多可产生4种黏性末端。根据图甲所示的载体信息，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-GTTT-3'和5'-AAAC-3'。 【小问2详解】 根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在Sac Ⅰ酶切位点上存在差异，BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，所展示的电泳结果可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶Sac Ⅰ，限制酶Sac Ⅰ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯和突变的植株。 【小问3详解】 根据题意可知，在实验当中获得了一株基因l成功突变的纯合之中，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测呢却发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2=1/4，纯突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 3、（2023山东高考） 科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 （1）与图甲中启动子结合的酶是____________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有________________（答出2个结构即可）。 （2）构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物___________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_____________（填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。 （3）重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了__________，条带2所检出的蛋白______________（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。 【答案】（1） ①. RNA聚合酶 ②. 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等 （2） ①. F2和R1或F1与R2 ②. a链 （3） ①. J-V5融合蛋白 ②. 不是 【解析】 【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是荧光蛋白基因或产物能显色的基因。 【小问1详解】 基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。 【小问2详解】 据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。 【小问3详解】 据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的融合的J基因表达的。 4、（2022山东高考） 关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（ ） A. 过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B. 离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C. 在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D. 粗提取的DNA中可能含有蛋白质 【答案】B 【解析】 【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是：①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出，从而达到分离的目的；②DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离；③在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。 【详解】A、低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确； B、离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误； C、在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确； D、细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一块儿析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。 故选B。 5、（2022山东高考） 某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。 （1）为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_______、为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______（填“3'端”或“5'端”）。 （2）PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是______。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是______。 （3）融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是______；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是______。 （4）根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是______。 【答案】（1） ①. 能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸 ②. 5'端 （2） ①. P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取。 ②. 在引物中的EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基 （3） ①. 增强FLAG-P与UBC的结合 ②. 参与P与UBC的结合 （4）药物A通过增强P与UBC结合促进P降解。 【解析】 【分析】PCR过程：①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解旋为单链；②温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 【小问1详解】 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3'端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5'端。 【小问2详解】 融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。 【小问3详解】 ①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAG-P，出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAG-P，杂交带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAG-P的结合。由②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG-P，出现杂交带；④⑤组使用FLAG-P△，不出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。 【小问4详解】 根据（3）的分析推测，药物A促进UBC与FLAG-P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。 【点睛】本题难点在于分析翻译出错的原因，需要结合翻译相关知识对图进行仔细分析方可得出结论。 6、（2020山东高考） 双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）与脱氧核苷三磷酸（dNTP）的结构如图所示。已知ddNTP按碱基互补配对的方式加到正在复制的子链中后，子链的延伸立即终止。某同学要通过PCR技术获得被32p标记且以碱基“C”为末端的、不同长度的子链DNA片段。在反应管中已经有单链模板、引物、DNA聚合酶和相应的缓冲液等，还需要加入下列哪些原料 ①dGTP，dATP，dTTP，dCTP ②dGTP，dATP，dTTP ③α位32p标记的ddCTP ④γ位32p标记的ddCTP A. ①③ B. ①④ C. ②③ D. ②④ 【答案】A 【解析】 【分析】PCR条件包括：模板、引物、耐高温DNA聚合酶、四种脱氧核苷三磷酸（dNTP），还需要一定的离子浓度等。 【详解】PCR扩增DNA时，需要dGTP、dATP、dTTP、dCTP作为原料，而脱氧核苷三磷酸（dNTP）连接到子链上时，会断掉2个高能磷酸键，为了获得被32p标记且以碱基“C”为末端的，32p标记应位于ddCTP的α位，加入ddCTP后会终止子链的延伸，获得不同长度的子链DNA片段，故需要①③，A正确。 7、（2020山东高考） 研究人员用三种基因探针，通过分子杂交技术分别对某动物三种细胞中的mRNA进行检测，结果如下表所示。下列说法错误的是 细胞 杂交带 探针 输卵管细胞 未成熟红细胞 胰岛B细胞 卵清蛋白基因探针 有 无 无 β—珠蛋白基因探针 无 有 无 胰岛素基因探针 无 无 有 A. 三种探针的核苷酸序列不同 B. 有杂交带出现表明相应基因发生了转录 C. 用上述探针分别检测三种细胞的DNA，实验结果不变 D. 可用mRNA逆转录产生的DNA制作相应基因的探针 【答案】C 【解析】 【分析】根据题意，利用特定基因制作基因探针，分别对某动物三种细胞中的mRNA进行检测，利用的原理是基因探针和mRNA之间可以发生碱基互补配对，由于不同的基因是选择性表达的，因此不同细胞中的mRNA是不完全相同的。 【详解】A、由于基因不同，因此制备的三种探针的核苷酸序列也不同，A正确； B、有杂交带出现表明探针和mRNA之间发生了碱基互补配对，即相应基因发生了转录，B正确； C、同一生物不同细胞中遗传物质相同，故用上述探针分别检测三种细胞的DNA，都会出现杂交带，C错误； D、可用mRNA逆转录产生的DNA，带上相应的标记后制作成相应基因的探针，D正确。故选：C。 8、（2020山东高考） 基因定点整合可替换特定基因，该技术可用于单基因遗传病的治疗。苯丙酮尿症是由PKU基因突变引起的，将正常PKU基因定点整合到PKU基因突变的小鼠胚胎干细胞的染色体DNA上，替换突变基因，可用来研究该病的基因治疗过程。定点整合的过程是：从染色体DNA上突变PKU基因两侧各选择一段DNA序列HB1和HB2，根据其碱基序列分别合成HB1和HB2，再将两者分别与基因、连接，中间插入正常PKU基因和标记基因，构建出如图所示的重组载体。重组载体和染色体DNA中的HB1和HB2序列发生交换，导致两者之间区域发生互换，如图所示。 （1）构建重组载体时，常用的工具酶有________。该实验用小鼠胚胎干细胞作为PKU基因的受体细胞以培育出转基因小鼠，除了胚胎干细胞能大量增殖外，还因为胚胎干细胞_________。 （2）为获得小鼠的胚胎干细胞，可将小鼠囊胚中的_________取出，并用_________处理使其分散成单个细胞进行培养，培养过程中大部分细胞会贴附在培养瓶的表面生长，这种现象称为___________。 （3）用图中重组载体转化胚胎干细胞时，会出现PKU基因错误整合。错误整合时，载体的两个中至少会有一个与一起整合到染色体DNA上。已知含有的细胞具有G418的抗性，、的产物都能把DHPG转化成有毒物质而使细胞死亡。转化后的胚胎干细胞依次在含有G418及同时含有G418和DHPG的培养液中进行培养，在双重选择下存活下来的是__________的胚胎干细胞，理由是_________。 （4）将筛选得到的胚胎干细胞培育成小鼠，从个体生物学水平检测，若小鼠__________，说明PKU基因成功表达。 【答案】 ①. 限制酶和DNA连接酶 ②. 具有全能性 ③. 内细胞团细胞 ④. 胰蛋白酶或胶原蛋白酶 ⑤. 贴壁生长 ⑥. 正确互换整合 ⑦. 正确互换整合后的染色体上只有只有，无、，具有G418抗性，故能在含有G418和DHPG的培养液中生长，错误互换整合后的细胞中染色体DNA上含有和至少1个，而、的产物都能把DHPG转化成有毒物质，故在含有G418和DHPG的培养液中错误整合的细胞死亡 ⑧. 尿液中霉臭味显著降低 【解析】 【分析】DNA重组技术至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。构建重组载体时，首先需用限制性核酸内切酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶连接目的基因和运载体形成重组载体。胚胎干细胞简称ES或EK细胞，来源于早期胚胎或原始性腺（即囊胚期的内细胞团），因此获取的胚胎干细胞应取自囊胚的内细胞团。结合题图可知，正常互换后的染色体DNA上只有，而无、；错误整合时，载体的两个中至少会有一个与一起整合到染色体DNA上，故由于正确互换后的细胞染色体上有，无、，故对G418有抗性，可在含G418的培养液中正常生活，而错误互换后的染色体DNA上由于含有至少1个，而、的产物都能使细胞死亡，故错误互换的细胞不能生存，据此分析。 【详解】（1）构建重组载体时，常用的工具酶有限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶。实验用小鼠胚胎干细胞作为PKU基因的受体细胞，除了胚胎干细胞能大量增殖外，还因为胚胎干细胞具有全能性。 （2）为获得小鼠的胚胎干细胞，可将小鼠囊胚中的内细胞团细胞取出，并用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理使其分散成单个细胞进行培养，培养过程中大部分细胞会贴附在培养瓶的表面生长，这种现象称为贴壁生长。 （3）已知含有的细胞具有G418的抗性，、的产物都能把DHPG转化成有毒物质而使细胞死亡，据分析可知，正确互换后的染色体上只有只有，无、，错误互换后的细胞中染色体DNA上含有和至少1个，因此，转化后的胚胎干细胞依次在含有G418及同时含有G418和DHPG的培养液中进行培养，在双重选择下存活下来的是正常互换整合的胚胎干细胞，原因是：正确互换后的染色体上只有只有，无、，具有G418抗性，故能在含有G418及同时含有G418和DHPG的培养液中生长，错误互换后的细胞中染色体DNA上含有和至少1个，而、的产物都能把DHPG转化成有毒物质，因此在含有G418和DHPG的培养液中死亡。 （4）苯丙酮尿症是由于苯丙氨酸代谢途径中的酶缺陷，使得苯丙氨酸不能转变成为酪氨酸，导致苯丙氨酸及其酮酸蓄积，并从尿中大量排出，主要表现为智力低下，尿液中有霉臭味，将筛选得到的胚胎干细胞培育成小鼠，若PKU基因成功表达，则从个体生物学水平检测，小鼠尿液中霉臭味显著降低。 【点睛】本题考查了基因工程和胚胎工程等相关知识，要求学生能够识记胚胎干细胞的来源，明确基因表达载体构建过程及目的基因的表达和检测，本题难点在于序列交换后细胞的筛选。 9、（2021山东高考） 粗提取 DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（ ） A. 加入适量的木瓜蛋白酶 B. 37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟 C. 加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精 D. 加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L 【答案】A 【解析】 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解DNA，过滤后在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物，A正确； B、37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在60~75℃的水浴箱中保温 10～15 分钟，使蛋白质变性析出，B错误； C、向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中，C错误； D、加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L，DNA在0．14mol/L的NaCl溶液中溶解度小，DNA析出，不会进入滤液中，D错误。 故选A。 10、（2021山东高考） 人类γ基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。 （1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是____，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是_____。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要____种酶。 （2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是____。 （3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于_____，理由是___。 【答案】 ①.（2021山东高考） SalI ②.（2021山东高考） EcoRI ③.（2021山东高考） 6 ④.（2021山东高考） F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达 ⑤.（2021山东高考） 引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 ⑥.（2021山东高考） 根据有无荧光情况判断，F1～F4 与 R 扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于 F4 所对应调控序列的下游（右侧）；F5～F6 与 R 扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游（左侧），所以结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 【解析】 【分析】1、据题意可知，科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，据图中注释可知，F1~F7以及R位置均为引物，故扩增的序列分别是引物F1和引物R之间的序列，引物F2和引物R之间的序列，引物F3和引物R之间的序列，引物F4和引物R之间的序列，引物F5和引物R之间的序列，引物F6和引物R之间的序列，引物F7和引物R之间的序列； 2、据图中对限制酶的注释可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，限制酶Xho Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶Sal Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同。 【详解】（1）据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶Mun Ⅰ 识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有Mun Ⅰ 和 Xho Ⅰ 的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 所识别，故应该选用添加限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，据图中对限制酶的注释可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，故 R 末端添加的序列所对应的限制酶是EcoR Ⅰ ，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是Sal Ⅰ ；荧光蛋白基因中含有限制酶EcoR Ⅰ 的识别位点，故对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割。综上所述，对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割，对扩增后的产物用限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用Taq酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是Taq酶、限制酶EcoR Ⅰ 、限制酶Sal Ⅰ、限制酶Mun Ⅰ 、限制酶Xho Ⅰ 、DNA连接酶； （2）受体细胞中已经除去 BCL11A 基因，故扩增产物中的 BCL11A 蛋白结合位点，不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要RNA聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达； （3）向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A基因表达，产生 BCL11A 蛋白， BCL11A 蛋白与BCL11A 蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含 F1～F4 与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F4与引物R之间的序列上；含 F5～F6 与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F5的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上。 【点睛】对基因工程中PCR技术的掌握，对基因工程的第二步，基因表达载体的构建的过程的分析，双酶切法的应用，限制酶的作用和切割特点，是解决本题的关键。 一、单选题 1．（2024·山东德州·二模）DNA分子的碱基具有吸收260nm波长光的特性。当DNA两条链碱基紧密连接时，吸光度偏低；两条链分离时，吸光度升高，因此DNA变性可通过DNA溶液对260nm波长光的吸光度来检测。肺炎链球菌DNA的变性曲线如图所示，吸光度达到最大值的50%时的温度称为熔解温度（Tm）。下列说法正确的是（　　） A．加热会破坏脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键使DNA变性 B．A、T碱基对所占比例越高的DNA，变性曲线中Tm值越高 C．加热至约70℃时DNA两条链从一端向另一端逐渐分离 D．利用PCR技术检测目的基因时需要先将DNA变性 【答案】D 【分析】DNA变性的本质原因是：DNA双螺旋分子结构在某种因素的作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使.DNA分子双螺旋结构疏散，双链裂解变成单链，进行解链反应，解链后即称为DNA变性。 【详解】A、加热是使DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA分子双螺旋结构疏散，双链裂解变成单链，进行解链反应，使DNA变性，A错误； B、A、T碱基对有两个氢键，C、G碱基对有三个氢键，A、T碱基对所占比例越高的DNA变性时需要的温度越低，即变性曲线中Tm值越低，B 错误； C、加热至约70℃时DNA两条链同时分离， C错误； D、利用PCR技术检测目的基因时，需要先将DNA变性，使DNA双链打开，D正确。 故选D。 2．（2024·山东威海·二模）ω-3多不饱和脂肪酸（LCPUFA）有预防心血管疾病的作用，但大多数动物体内不能合成。科研人员利用转染技术（将外源DNA转入受体细胞的技术）将LCPUFA—合成酶基因（fat-1基因，含1229bp）导入小鼠受精卵，培育出转基因小鼠，基本流程如下图甲所示。图乙表示提取不同实验组别小鼠受精卵DNA后，利用fat-1基因的引物进行PCR扩增后电泳的结果。下列说法错误的是（    ） A．采用农杆菌转化法可确保图甲中转染的效果 B．PCR扩增3轮后，只含一种引物的DNA分子的比例为1/4 C．由图乙可知，只有2组转染成功 D．若fat-l基因单点插入，则转基因小鼠相互交配产生的大多数后代体内能合成LCPUFA 【答案】A 【分析】1、PCR扩增：目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合；然后以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此循环多次。 2、选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：①不能破坏目的基因；②不能破坏所有的抗性基因；③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向连接，同时要防止目的基因自身环化和质粒的自身环化。 【详解】A、农杆菌转化法适用于植物细胞，对于动物细胞受精卵而言应采用显微注射法导入目的基因，A错误； B、PCR扩增3轮后，共得到8个DNA分子，只有最原始的1个DNA分子的两条链不含引物，导致含有这两条链的2个DNA分子只含有其中一种引物，其余6个DNA分子均含有2种引物，故PCR扩增3轮后，只含一种引物的DNA分子的比例为1/4，B正确； C、据图分析，M2组和1组没有扩增出DNA片段，故细胞内不存在目的基因，即可能是细胞内导入PEB质粒或者未成功转染，而M2组是PEB质粒转染细胞PCR产物，故1组是未转染细胞PCR产物，2组出现一条DNA条带，即为目的基因条带，则1组是未成功转染细胞PCR 产物；2组是成功转染细胞 PCR 产物，C正确； D、若fat-l基因单点插入，相应的基因型表示为FO，则转基因小鼠相互交配后代基因型为1FF、2FO、1OO，即产生的大多数后代体内能合成LCPUFA，D正确。 故选A。 3．（2024·山东·二模）由于PCR扩增出的目的基因末端为平末端，且无合适的限制酶识别序列，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。下图为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列，下列叙述正确的是（    ）    A．构建重组载体P时，应选择EcoRV进行酶切，再用T4DNA连接酶连接 B．为了便于该目的基因接入载体E，可用限制酶EcoRV或SmaI切割载体P C．载体P不能作为基因表达载体，是因为它不含起始密码子和终止密码子 D．若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，表明重组载体成功导入受体细胞 【答案】A 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：可利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测；①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因；②检测目的基因是否转录出了mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】AB、由于载体E只有产生黏性末端的酶切位点，要使中间载体P接入载体E，同时防止载体E自身环化，需要用两种限制酶分别切割载体E和中间载体P，据图可知，中间载体P和载体E均含有XhoI和PstI酶识别序列，故可选用XhoI和PstI酶进行酶切，载体P的这两种酶识别序列中含有EcoRV识别位点，并且其切割的为平末端，可以用于连接目的基因，SmaI酶虽然也能切割得到平末端，但是其识别位点没有位于XhoI和PstI酶识别位点之间，故不能选择其对中间载体P进行切割，连接平末端只能用T4DNA连接酶，A正确，B错误； C、由图可知，不直接选择P构建表达载体是因为它不含启动子与终止子，C错误； D、受体细胞表现出抗性基因的相应性状，可能是导入了重组质粒，也可能只导入了空质粒（不含目的基因的质粒），D错误。 故选A。 4．（2024·山东·模拟预测）研究人员用酶和酶两种限制酶同时处理某DNA分子和质粒，得到的DNA片段如图所示。图中DNA片段只注明了黏性末端处的碱基种类，其他碱基的种类未注明。下列叙述错误的是（    ） A．该DNA分子和质粒上均含有酶的一个切割位点和酶的一个切割位点 B．根据图示信息不能确定图中形成的不同黏性末端与这两种限制酶的对应关系 C．用T4D NA连接酶或E.coli DNA连接酶均可以将片段乙和片段丁连接起来 D．片段乙、片段丁、片段戊可依次连接形成一个环状DNA分子 【答案】D 【分析】1、分析图形：图中所示的是酶M和酶N两种限制酶切割含有目的基因的DNA片段和质粒的结果。 2、限制性核酸内切酶（限制酶）（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的； （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性； （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 【详解】A、该DNA分子经酶M和酶N两种限制酶切割后，产生了三个DNA片段且两个切口形成的黏性末端不同，说明该DNA分子含有酶M的一个切割位点和酶N的一个切割位点；质粒为环状DNA，其经酶M和酶N两种限制酶切割后，产生了两个DNA片段，观察两个切口形成的黏性末端，可推出质粒含有酶M的一个切割位点和酶N的一个切割位点，A正确； B、根据图中黏性末端可知，酶M和酶N识别的序列可能是或，但无法确定其对应关系，B正确； C、图中经酶切后形成的片段均是黏性末端，T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，也可以“缝合”双链DNA片段的平末端，而E.coliDNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，片段乙和片段丁黏性末端互补，C正确； D、根据图中黏性末端可知，片段乙、片段丁、片段戊三个片段不能连接成环状DNA分子，D错误。 故选D。 5．（2024·山东淄博·二模）dNTP（包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP）的结构与ATP类似，除碱基不同外，dNTP含有脱氧核糖。与dNTP相比，ddNTP的五碳糖为双脱氧核糖，其3'碳位为-H且不能与磷酸形成化学键。现有甲~丁四个PCR反应体系，甲体系中含有放射性磷标记的ddATP（记作ddATP+）和DNA模板链。PCR完成后，经电泳（分子量小的DNA在电场中移动快）将甲体系中一组长度不等的DNA单链分离。丙、乙、丁三个PCR体系与甲相似，分别用于检测T、C、G的碱基序列，检测结果如图。下列说法正确的是（    ） A．ddATP+中的放射性磷酸基团应位于ddATP的末端 B．甲体系中除含ddATP+外，还应含有dTTP、dGTP、dCTP C．新掺入脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接在子链的5'端 D．模板DNA的碱基序列为3'CTGGACTGACAT5' 【答案】D 【分析】DNA分子复制的场所、过程和时间： （1）DNA分子复制的场所：细胞核、线粒体和叶绿体； （2）DNA分子复制的过程： ①解旋：在解旋酶的作用下，把两条螺旋的双链解开； ②合成子链：以解开的每一条母链为模板，以游离的四种脱氧核苷酸为原料，遵循碱基互补配对原则，在有关酶的作用下，各自合成与母链互补的子链； ③形成子代DNA：每条子链与其对应的母链盘旋成双螺旋结构，从而形成2个与亲代DNA完全相同的子代DNA分子； （3）DNA分子复制的时间：有丝分裂的间期和减数第一次分裂前的间期。 【详解】A、由于ddNTP的五碳糖为双脱氧核糖，其3'碳位为-H且不能与磷酸形成化学键，因此ddATP+中的放射性磷酸基团不应位于ddATP的末端，A错误； B、甲体系中除含ddATP+外，还应含有dATP、dTTP、dGTP、dCTP，B错误； C、PCR扩增时，由5'端向3'端延伸，则新掺入脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接在子链的3'端，C错误； D、当 ddNTP 结合时，DNA 合成终止，因此DNA合成链可能随机停止在任何碱基处，根据四种碱基的条带位置反向推出DNA序列。 PCR扩增时，由5'端向3'端延伸，则根据电泳图及分子量小的DNA在电场中移动快可知，该DNA片段的待测碱基序列为5'GACCTGACTGTA3'，因此模板DNA的碱基序列为3'CTGGACTGACAT5'，D正确。 故选D。 6．（2024·山东济宁·三模）变性梯度凝胶电泳（DGGE）是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链程度的不同，导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。当DNA片段泳动到某一浓度的变性剂位置时，DNA发生解旋变性，导致电泳迁移率下降，最终会停留在某一位置。下列说法正确的是（    ） A．提高电泳的温度有利于提高分离效率 B．DGGE技术可用于基因突变检测及相关研究 C．DNA中的A、T碱基含量越高越不容易发生变性 D．电泳时需将待测DNA与电泳缓冲液混合后注入加样孔内 【答案】B 【分析】电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 【详解】A、DNA分子变性是由变性剂引起的，不是加热的结果，提高电泳的温度对提高分离效率无影响，A错误； B、据题意“DGGE是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开”，据此推测，DGGE技术可用于基因突变检测及相关研究，B正确； C、DNA中A和T之间有两个氢键，G和C之间有三个氢键，因此，DNA中的A、T碱基含量越高越容易发生变性，C错误； D、电泳时需将待测DNA与凝胶载样缓冲液混合，内含指示剂，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶加样孔内，D错误。 故选B。 7．（2024·山东·模拟预测）天然β-淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明显提升。我国学者借助PCR改造β-淀粉酶基因（如图，①~④表示引物片段），并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。下列相关叙述正确的是（    ）    A．PCR中使用的聚合酶属于以RNA为模板的DNA聚合酶 B．由图可知，β-淀粉酶基因改造方案中需用到引物①和④ C．改造后的基因应该插入pLN23质粒的起始密码子的下游 D．利用PCR在分子水平上确定目的基因是否转录需用到逆转录酶 【答案】D 【分析】基因工程的操作流程：目的基因的筛选与获取、构建基因表达载体、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、PCR的原理是DNA双链复制，利用的酶是耐高温的DNA聚合酶，合成子链时是以DNA为模板，A错误； B、根据β-淀粉酶的编码序列，替换的碱基在编码序列中，则利用的引物应该把编码序列全部扩增在内，则所用的引物是②③，B错误； C、改造后的基因应该插入pLN23质粒的启动子的下游，C错误； D、转录是以DNA为模板合成RNA的过程，通过PCR在分子水平上确定目的基因是否转录，则需要以RNA为模板逆转录出DNA作为PCR反应的模板，该过程需要用到逆转录酶，D正确。 故选D。 8．（2024·山东潍坊·二模）从大肠杆菌中提取某条mRNA逆转录形成一条cDNA单链并测序，测得该序列为5'-⋯CGTAGC，⋯-3'。现将该序列形成双链，构建表达载体并导入细胞中表达形成肽链。反密码子与对应的氨基酸关系如下表所示。下列说法错误的是（    ） 反密码子（方向为3'到5'） CGA CGU UGC ACG AGC GCU 氨基酸 丙氨酸 丙氨酸 苏氨酸 半胱氨酸 丝氨酸 精氨酸 A．5'-GCU-3'和5'-GCA-3'是编码丙氨酸的密码子 B．编码该mRNA的DNA序列的模板链与该cDNA单链序列相同 C．构建表达载体时该cDNA单链的3'端与启动子相连 D．该细胞表达的多肽序列为“⋯-丙氨酸-半胱氨酸-⋯” 【答案】D 【分析】转录是在细胞核内，以DNA一条链为模板，按照碱基互补配对原则，合成RNA的过程。 翻译是在核糖体中以mRNA为模板，按照碱基互补配对原则，以tRNA为转运工具、以细胞质里游离的氨基酸为原料合成蛋白质的过程。 【详解】A、由表格可知，丙氨酸的反密码子是3'-CGA-5'，3'-CGU-5'，编码丙氨酸的密码子5'-GCU-3'和5'-GCA-3'，A正确； B、cDNA单链是mRNA逆转录形成的，编码该mRNA的DNA序列的模板链与该cDNA单链序列都和mRNA的序列互补，因此它们的序列相同，B正确； C、启动子的作用是启动转录，子链的延伸方向5'到3'，因此cDNA单链的3'端与启动子相连，C正确； D、cDNA单链并测序，测得该序列为5'-⋯CGTAGC，⋯-3'，则mRNA的序列为3'-⋯GCAUCG⋯-5'，反密码子的序列5'-⋯CGUAGC，⋯-3'，对照表格可知，细胞表达的多肽序列不是“⋯-丙氨酸-半胱氨酸-⋯”，D错误。 故选D。 9．（2024·山东济南·三模）临床上可采用PCR 和DNA反向点杂交相结合的检测技术对HPV基因进行分型，过程如下：设计出针对已知有致癌风险的23种HPV基因的特异性引物并标记上会发生显色反应的生物素，通过 PCR 对待测样本 DNA 进行扩增，再将扩增产物直接与固定在膜上的分型基因探针（包括17种高危型和6种低危型）进行杂交。经显色处理后，与固定化探针结合的HPV基因就会在相应位置产生显色反应，从而判断待测样本是否被含有这些 HPV基因的病毒感染。有关说法错误的是（　　） A．生物素应标记在引物的5’端 B．该检测技术需要对扩增的DNA样本进行琼脂糖凝胶电泳 C．该检测技术具有高度的特异性，能够准确地区分不同类型的HPV 病毒 D．反向点杂交是通过分型基因探针与扩增的目的片段碱基互补配对结合在一起的 【答案】B 【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【详解】A、引物作用是使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸，生物素应标记在引物的5’端，A正确； B、该检测技术需要对扩增产物直接与固定在膜上的分型基因探针进行杂交，不需要进行琼脂糖凝胶电泳，B错误； C、该检测技术利用扩增产物和基因探针特异性结合，能够准确地区分不同类型的HPV 病毒，具有高度特异性，C正确； D、分型基因探针与扩增的目的片段结合的原理是碱基互补配对原则，D正确。 故选B。 10．（2024·山东滨州·二模）染色体DNA复制时需要一小段RNA作为引物，这是因为DNA聚合酶只能从引物的3'端连接脱氧核苷酸。复制时两条子链的延伸方向相反，其中一条子链称为前导链，该链连续延伸，另一条称为后随链，该链逐段延伸，这些片段称为冈崎片段，如图1所示。图2表示图1中一段RNA引物去除并修复的过程。下列说法错误的是（　　） A．酶1可以切除RNA片段，但不能切除与脱氧核苷酸连接的核糖核苷酸 B．染色体DNA复制需要RNA聚合酶、DNA连接酶的参与 C．每个冈崎片段的形成和其引物去除并修复的过程需两次DNA聚合酶的催化 D．染色体DNA复制结束并切除所有引物后形成的两个子代DNA分子碱基序列完全相同 【答案】D 【分析】据图可知，DNA半保留复制过程是分别以解旋后的两条链为模板，以细胞中游离的4种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则，各自合成与母链互补的一条子链，子链的延伸方向是从5´→3´，分为前导链和后随链，前导链的合成是连续的，后随链的合成是不连续的，据此分析。 【详解】A、由图2可知，酶1可以切除相应的RNA引物片段，由于酶具有专一性，因此酶1不能切除与脱氧核苷酸连接的核糖核苷酸，A正确； B、由题意可知，染色体复制时需要合成一小段RNA作为引物，因此需要RNA聚合酶的参与，后随链合成时会先形成多个DNA单链的片段（冈崎片段），之后需要DNA连接酶相连接，B正确； C、在引物RNA合成基础上，进行DNA链的5′～3′方向合成，在DNA聚合酶的作用下前导链连续地合成出一条长链，后随链合成出冈崎片段，去除RNA引物后，片段间形成了空隙，DNA聚合酶作用使各个片段靠近，在连接酶作用下，各片段连接成为一条长链，即每个冈崎片段的形成和其引物去除并修复的过程需两次DNA聚合酶的催化，C 正确； D、染色体DNA复制结束并切除所有引物后形成的两个子代DNA分子可能因基因突变碱基序列不完全相同，D错误。 故选D。 11．（2024·山东泰安·二模）稻米胚乳直链淀粉含量高会导致食用品质差。研究发现，水稻蜡质基因（Wx）编码直链淀粉合成酶。若Wx基因中第226位碱基是正常的G，该位点所在内含子能被正常剪接，胚乳中直链淀粉含量最高，基因型记做GG；若该位点突变成T，则不能被正常剪接，胚乳中直链淀粉合成水平会降低，基因型记做TT。为检测Wx基因该位点碱基是G或T，研究人员以待测水稻叶片总DNA为材料，以Wx基因片段设计引物如图所示，对PCR扩增产物经AccⅠ酶切后电泳。已知引物1为5'-GCTTCACTTCTCTGCTTGTG-3'，两引物之间无另外的AccⅠ酶的识别位点。下列说法正确的是（    ） A．该实验中需设计的引物2为5'-TTCAACTCTCGTTAAATCAT-3' B．若酶切产物只能观察到450bp的DNA条带，则表明该水稻品种为TT型 C．GT杂合型水稻品种酶切电泳结果为3条条带 D．组成上述两种淀粉合成酶的氨基酸种类不同，数目相同 【答案】C 【分析】用PCR扩增DNA片段的过程中，脱氧核苷酸只能加在引物3'端，子链延长方向是5'→3'，故引物的碱基序列应与每条模板链5'端的一段核苷酸链的碱基序列相同，即应以模板链5'端的一段脱氢核苷酸单链片段作引物。 【详解】A、分析题图可知，引物的延伸方向为5'→3'，故图示所给引物1设计区碱基序列所在的DNA链为非模板链，故引物1的碱基序列与非模板链的碱基序列相同，而引物2要以引物2设计区碱基序列所在的DNA链为模板，故引物2的碱基序列应与所给序列碱基互补配对，该实验中需设计的引物2为5'－ATGATTTAACGAGAGTTGAA－3'，A错误； B、PCR产物从71bp开始，到530bp为止，共460bp。若被切为大概150bp、300bp的两段，说明PCR产物可被酶切，则基因型应为GG，若PCR产物不被酶切，电泳后只有一条450bp左右的条带，则基因型为TT，B错误； C、若Wx基因中第226位碱基是正常的G，该位点所在的内含子能被正常剪接，胚乳中直链淀粉含最高，基因型记做GG；若该位点突变成T，则不能被正常剪接，胚乳中直链淀粉的合成水平会降低，基因型记做TT，故GT杂合型水稻品种的G能被酶切成两段，而T不能被酶切，故酶切电泳结果为3条条带，C正确； D、组成上述两种淀粉合成酶的氨基酸的数目不同，D错误。 故选C。 12．（2024·山东·二模）可利用基因芯片技术检测棉花基因在胚珠和纤维组织中的表达情况，基因芯片的制作和检测流程如下；将棉花基因组中的各基因分别进行PCR扩增→再将各基因扩增产物按一定顺序点在玻璃板上的相应位置，变性、固定→分别从棉花胚珠和纤维中分离总mRNA，反转录生成cDNA→将两种cDNA分别用绿色和红色荧光染料标记→将标记后的cDNA与基因芯片杂交→进行荧光检测（若绿色和红色叠加则呈现黄色）。下列说法错误的是（    ） A．逆转录过程与芯片杂交过程的碱基互补配对方式相同 B．若芯片上某基因处的红色荧光较强，说明该基因在棉花纤维组织中表达水平较高 C．若芯片上某基因处显示黄色，可能是由于该基因在两种组织中均表达 D．若某基因处只出现红色或绿色，该基因可能是组织特异性表达的基因 【答案】A 【分析】逆转录是指以RNA为模板合成DNA的过程，需要逆转录酶，以四种游离的脱氧核苷酸为原料，消耗能量。 【详解】A、逆转录过程与芯片杂交过程的碱基互补配对方式不相同，前者存在A—T、U—A、G—C、C—G，后者存在A—T、T—A、G—C、C—G，A错误； B、分别从棉花胚珠和纤维中分离总mRNA，反转录生成cDNA，将两种cDNA分别用绿色和红色荧光染料标记，故若芯片上某基因处的红色荧光较强，说明该基因在棉花纤维组织中表达水平较高，B正确； C、结合题干，若绿色和红色叠加则呈现黄色，故若芯片上某基因处显示黄色，可能是由于该基因在两种组织中均表达，C正确； D、依据题意，若某基因处只出现红色或绿色，说明该基因发生了选择性表达，产生了相应的mRNA，D正确。 故选A。 13．（2024·山东日照·二模）反向PCR是利用已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图。下列叙述错误的是（    ） A．过程①可用同种限制酶切割磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键 B．过程②需用DNA连接酶将酶切片段环化以实现对未知序列的扩增 C．过程③需添加方向相对的引物1和3以便DNA聚合酶从其3′端延伸子链 D．过程③中将温度调至72℃的目的是使引物与模板链通过碱基互补配对结合 【答案】D 【分析】1、PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR可扩增一段已知序列的两端未知序列。反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。2、如图所示，DNA分子被限制酶切割，然后环化并加入已知序列合成的引物，再通过PCR扩增得到中间是未知序列两侧是已知序列的DNA分子。 【详解】A、由图可知，过程①即酶切后，已知序列能环化，说明两端的黏性末端相同，故过程①是用同一种限制酶对未知序列两端进行切割，A正确； B、过程②即环化，将DNA片段连接起来，该过程中使用DNA连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键，B正确； C、过程③为扩增，需添加方向相对的引物1和3以便DNA聚合酶从其3′端延伸子链，C正确； D、过程③中将温度调至72℃的目的是耐高温的DNA聚合酶，将四种脱氧核苷酸根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，D错误。 故选D。 14．（2024·山东济宁·二模）关于“DNA粗提取和鉴定”以及“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法错误的是（　　） A．将洋葱研磨液离心是为了加速杂质的沉淀 B．根据DNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同，可去除部分杂质 C．DNA分子在电场作用下可以带上正电荷或负电荷 D．PCR实验中使用的微量离心管和枪头在使用前需进行高压灭菌处理 【答案】C 【分析】电泳法：利用分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种分子的分离。原理：在一定的pH下，多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 【详解】A、将洋葱研磨液离心是为了加速杂质的沉淀，A正确； B、根据DNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同，可去除部分杂质，B正确； C、DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带点分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，C错误； D、PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水在使用前都必须进行高压蒸汽灭菌处理，D正确。 故选C。 15．（2024·山东枣庄·二模）DNA的双链中，转录时作为模板功能的链叫作反义链，另一条叫作有义链。下图是DNA分子中某些基因有义链和反义链示意图。下列说法错误的是（　　） A．根据启动子和终止子的相对位置可以判断哪条链作为反义链 B．不同的基因可能同时复制，也可能同时转录 C．DNA分子的一条链对不同基因来说，有的是有义链，有的是反义链 D．基因的转录和翻译都是沿着模板的3'端到5'端进行的 【答案】D 【分析】RNA是在细胞核中，以DNA的一条链为模板合成的，这一过程称为转录。翻译指游离在细胞质内的各种氨基酸，以mRNA为模板合成具有一定氨基酸顺序的蛋白质的过程。 【详解】A、启动子的作用是RNA聚合酶识别和结合的位点，驱动基因转录，因此根据启动子和终止子的相对位置可以判断哪条链作为反义链，A正确； B、不同的基因位置不同可能同时复制，也可能同时转录，B正确； C、由图可知，不同基因的有义链和反义链不同，因此DNA分子的一条链对不同基因来说，有的是有义链，有的是反义链，C正确； D、基因的转录是沿着模板的3'端到5'端进行的，翻译是沿着模板的5'端到3'端进行的，D错误。 故选D。 二、多选题 16．（2024·山东青岛·三模）科学家将某病毒抗原蛋白的部分编码序列（RBD）拼接成融合基因2RBD和3RBD，探究RBD的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟RBD的天然构象并获得高效免疫原性。为鉴定重组质粒是否构建成功，将重组质粒用Nco I和Sac I双酶切处理后电泳，结果如图，其中泳道1为双酶切pNZ8149-2RBD，两个条带大小分别为2507bp和2020bp。将构建好的重组质粒分别导入工程菌中进行表达产物的检测。下列说法正确的是（    ） A．PCR扩增融合基因时，在引物的3'端添加相应限制酶的识别序列 B．据图可知，融合基因3RBD的长度为2686bp C．泳道2呈现一个条带的原因是酶切pNZ8149-3RBD后产生的两个片段大小相近 D．从工程菌细胞表面提取蛋白质进行检测，从而进一步比较两者的免疫原性 【答案】BCD 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、引物使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，PCR扩增融合基因时，在引物的5'端添加相应限制酶的识别序列，A错误； B、由图可知pNZ8149-2RBD和pNZ8149-3RBD的碱基对分别为4527bp和5193bp，所以RBD长度为5193-4527=666bp，泳道1为双酶切pNZ8149-2RBD，两个条带大小分别为2507bp和2020bp，所以融合基因3RBD的长度为666+2020=2686bp，B正确； C、由图可知，泳道2呈现一个条带，其原因是双酶切pNZ8149-3RBD后产生的两个片段大小相近，C正确； D、“该实验的目的是“探究RBD的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟RBD的天然构象并获得高效免疫原性”，可以从工程菌细胞表面提取蛋白质进行检测，从而进一步比较两者的免疫原性，D正确。 故选BCD。 17．（2024·山东临沂·二模）丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）引起的一种传染病。为研制针对HCV的多肽疫苗，某研究小组构建LTB-R9-Bp融合基因的过程如图，进而构建出融合基因表达载体，其中LTB是一种免疫增强剂基因，R9-Bp是HCV两个相连的包膜蛋白基因。下列说法正确的是（    ） A．PCR反应体系中需加入待扩增的模板、引物、原料以及耐高温的DNA聚合酶 B．若要大量扩增LTB-R9-Bp融合基因，可选择引物P2和引物P3继续进行PCR C．融合基因表达载体的组成元件有融合基因、标记基因、启动子和终止密码子等 D．若利用转基因植物生产该疫苗，需用到基因工程、植物组织培养和抗原抗体杂交技术 【答案】AD 【分析】基因工程的操作步骤：(1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；(2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术。②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术。③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术，个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、PCR扩增时，需要再反应体系中加入待扩增的模板、引物、原料以及耐高温的DNA聚合酶，A正确； B、通过PCR技术扩增LTB-R9-Bp融合基因，需要与融合基因两端序列互补配对的引物，结合图示分析，可选择引物P1和引物P4继续进行PCR，B错误； C、终止密码子存在于mRNA上，不会存在于融合基因中，C错误； D、若利用转基因植物生产该疫苗，则需要通过基因工程获得含有目的基因的受体细胞，再通过植物组织培养获得具备产生疫苗的植物，最终需要通过抗原抗体杂交技术进行目的基因成功表达的鉴定，D正确。 故选AD。 18．（2024·山东青岛·二模）TaIBH1-2D是小麦中一个调控千粒重的关键基因。为验证TaIBHI-2D的功能，研究人员构建了过表达株系，可利用酶切法检验TaIBH1-2D与载体是否连接，图1三个泳道分别是用不同的限制酶完全酶切后（只考虑图示酶切位点），产物经琼脂糖凝胶电泳的结果；同时构建了敲除TaIBH1-2D基因的突变体。图2统计了不同植株的千粒重。下列说法正确的是（    ） A．电泳的缓冲液中含指示剂，可在紫外灯下被检测出来 B．泳道1为单酶切空载体，泳道2为单酶切的重组载体 C．泳道3为双酶切的重组载体，且目的基因与载体正确连接 D．由图2分析，TaIBH1-2D负调控小麦千粒重 【答案】BD 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成. （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等. （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法. （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术.个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A缓冲液中的指示剂指示电泳进程，核酸染料加在凝胶中，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300n m的紫外灯下被检测出来，A错误； B、泳道1的质粒长度小于泳道2，则泳道1为单酶切空载体，泳道2为单酶切的重组载体，B正确； C、泳道3有一个条带的大小与泳道1相同，且还有两个较小的条带，则为限制酶A和限制酶B双酶切的重组载体，但是无法判断目的基因与载体是否正确连接，C错误； D、由图2分析，含有TaIBH1-2D基因的植株千粒重小于野生植株和敲除突变体，则说明TaIBH1-2D负调控小麦千粒重，D正确。 故选BD。 19．（2024·山东泰安·模拟预测）为使玉米获得抗除草剂性状，科研人员进行了相关操作(如图所示)。含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达，其正确表达产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列叙述错误的是（    ）        A．T-DNA可将基因G转移并整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上 B．利用物质K和抗生素进行筛选1，可获得农杆菌的蓝色菌落 C．利用物质K和除草剂进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株 D．提高培养基中细胞分裂素和生长素的比值，有利于诱导生根 【答案】BD 【分析】农杆菌转化法的具体过程： （1）利用土壤农杆菌的Ti质粒构建基因表达载体，即将目的基因整合到土壤农杆菌的Ti质粒上。 （2）将整合了目的基因的Ti质粒导入土壤农杆菌细胞内。 （3）利用土壤农杆菌感染植物细胞，该过程实际上是将含有目的基因的土壤农杆菌Ti质粒导入植物细胞内。 （4）含有目的基因的土壤农杆菌Ti质粒进入植物细胞后，可以把自己的一段基因整合到细胞核中的染色体上，这段基因中包含了目的基因。 【详解】A、农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，根据农杆菌的这一特点，将目的基因（基因G）插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因（基因G）整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上，A正确； B、农杆菌属于原核生物，含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达，故不会出现农杆菌的蓝色菌落，B错误； C、根据题意可知，报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色，而愈伤组织表面残留的农杆菌会导致未转化的愈伤组织能在含除草剂的培养基中生长，因此利用物质K和除草剂进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株，C正确； D、提高培养基中细胞分裂素和生长素的比值，有利于诱导生芽，D错误。 故选BD。 20．（2024·山东·模拟预测）科学家发现一种名为Tat-SIRT5-CTM的细胞穿透肽，其可以抑制小胶质细胞中炎症细胞因子的表达，使神经元免受损伤。研究者欲通过基因工程来生产Tat-SIRT5-CTM，如图是采用PCR技术检测目的基因插入染色体的位置的流程图。下列说法正确的是（　　） A．Tat-SIRT5-CTM可防止某些疾病造成脑损伤 B．可利用抗原—抗体杂交技术检测穿透肽的表达量 C．转基因技术中目的基因插入染色体的位点通常具有确定性 D．Ⅰ过程不能利用不同的限制酶切割，来构建图中的环状DNA 【答案】AB 【分析】基因工程的操作步骤有：目的基因的获取、构建基因表达载体、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和鉴定。检测目的基因是否导入受体细胞可采用PCR技术，检测目的基因是否表达可采用抗原抗体杂交或个体水平检测。 【详解】A、由于Tat-SIRT5-CTM可抑制小胶质细胞中炎症细胞因子的表达，保护神经元免受损伤，因此Tat-SIRT5-CTM可防止某些疾病造成脑损伤，A正确； B、穿透肽本质是蛋白质，因此可用抗原—抗体杂交技术检测其表达量，B正确； C、转基因技术中目的基因会随机整合到宿主细胞的染色体上，因此插入的位点通常具有不确定性，C错误； D、有些限制酶切割形成的黏性末端相同，因此I过程可以利用不同的限制酶切割，来构建图中的环状DNA，D错误。 故选AB。 三、非选择题 21．（2024·山东青岛·三模）乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因（LDH）插入酿酒酵母表达载体pAUR123（图1）中，经过转化、筛选、鉴定和培养，获得了产乳酸的商用酿酒酵母菌。 (1)研究者将LDH基因编码序列中的同义密码子（一种氨基酸有两种或者两种以上的遗传密码子）替换为酿酒酵母偏好的密码子，替换的目的是 。再通过 法将核苷酸按照顺序一个一个连接起来，由此获得少量的LDH。 (2)图2所示LDH的部分序列和相应限制酶识别序列，AUG为真核生物偏好的起始密码子，利用E．coliDNA连接酶将LDH正确插入pAUR123载体时，应分别选择 、 对目的基因和载体进行酶切处理。 (3)将得到的重组pAUR123表达载体，转入经 处理的大肠杆菌，接种于液体培养基中进行培养，其目的是 。再将重组表达载体和不能合成尿嘧啶的酿酒酵母细胞悬液混合，转化后的细胞稀释涂布于不含尿嘧啶的培养基中进行筛选，据此推测，pAUR123上的标记基因为 。 (4)通过 技术检测酿酒酵母菌株中是否转录出LDH的mRNA。欲对转LDH基因酿酒酵母发酵产乳酸能力进行检测，其实验思路是 。 【答案】(1) 提高翻译效率 化学合成法 (2) TthHBⅠ和BamHⅠ TthHBⅠ和BclⅠ (3) Ca2+ 扩增重组pAUR123表达载体 尿嘧啶合成酶基因 (4) DNA分子杂交技术 将转基因和非转基因酿酒酵母分别接种在液体培养基中，进行连续培养，定时采用血细胞计数板在显微镜下计数细胞密度，并检测培养液中乳酸浓度。 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1） 根据题干信息，研究者需要将牛的乳酸脱氢酶A基因（LDHA）插入酿酒酵母中进行培养，所以将其编码序列中的同义密码子替换为酿酒酵母偏好的密码子的目的是为了提高翻译的效率，利于基因的表达，然后再通过化学合成的方法，合成少量的LDHA。 （2）E．coliDNA连接酶只能连接黏性末端，故质粒应该用限制酶BclⅠ和TthHBⅠ进行切割，目的基因中没有BclⅠ的识别序列，但含有BamHⅠ和TthHBⅠ的识别序列，BamHⅠ和BclⅠ产生的黏性末端相同，故应该用BamHⅠ和TthHBⅠ对目的基因进行切割。 （3） 得到基因表达载体后，受体细胞若是大肠杆菌，通常采用Ca2+处理，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，即感受态时，再将基因表达载体导入其中。然后接种于LB液体培养基中，于37℃下振荡培养，其目的是实现pAUR123表达载体的扩增。再将重组表达载体和不能合成尿嘧啶的酿酒酵母细胞悬液混合，转化后的细胞稀释涂布于不含尿嘧啶的培养基中进行筛选，据此推测，pAUR123上的标记基因为尿嘧啶合成酶基因。 （4）要检测酿酒酵母菌株中是否转录出LDH的mRNA，可以DNA分子杂交技术进行检测。欲对转LDH基因酿酒酵母发酵产乳酸能力进行检测，其实验思路是：将转基因和非转基因酿酒酵母分别接种在液体培养基中，进行连续培养，定时采用血细胞计数板在显微镜下计数细胞密度，并检测培养液中乳酸浓度。 22．（2024·山东菏泽·一模）酵母是一种能够引发有机源或者动物源物质发酵的真菌，它有许多分类，其中酿酒酵母是知名度最高，也是与人类关系最广泛的一种酵母。我国是世界上啤酒生产和消费大国，啤酒是以大麦为主要原料经酵母发酵制成的。请回答下列问题： (1)为了制备啤酒酵母分离培养基，实验人员将马铃薯去皮切块后高压煮沸，过滤后补加蒸馏水至1L，加入葡萄糖和琼脂后加热融化。将马铃薯高压煮沸的目的是 ，该培养基的碳源主要包括 ，用于装培养基的培养皿一般用 法进行灭菌处理。 (2)啤酒在工业化生产过程中，发酵过程分为 两个阶段。第一阶段结束后，发酵液在 的环境下储存一段时间进行第二阶段，形成澄清、成熟的啤酒。 (3)下图所示为用酿酒酵母生产乙肝疫苗的过程图，回答相关问题： ①研究人员拟用PCR扩增目的基因片段，已知目的基因的一条链为5'—ATTCCATATC……CCATGCC—3'。在PCR反应体系中需加入缓冲液、引物、4种脱氧核苷酸、含目的基因的DNA模板以及 。设计了一条引物为5'—GGCATG—3'，另一条引物为 （写出6个碱基即可）。 ②要形成有效的重组质粒，选择适当的限制酶很重要，根据图乙和图丙可知，选择 最佳，原因是 。 ③在添加卡那霉素和四环素的培养基中有少量菌落，说明了 。 【答案】(1) 灭菌，以防杂菌污染 淀粉和葡萄糖等 干热灭菌 (2) 主发酵阶段、后发酵阶段 低温、密闭 (3) 耐高温的DNA聚合酶 5’—ATTCCA—3’ BamHⅠ和EcoRⅠ 既防止了质粒和目的基因的自身环化和反向连接，又便于筛选出含有目的基因的受体细胞 这些菌落不含目的基因 【分析】1、发酵工程一般包括菌种的选育、扩大培养、培养基的配制、灭菌、接种、发酵罐内发酵、产品的分离、提纯等方面。酵母菌的新陈代谢类型为异养兼性厌氧型。 2、对比传统获得疫苗和通过基因工程获得疫苗的过程基因工程获得疫苗具有重要优势。图甲表示的是通过基因工程获得疫苗和产生相应抗体的过程图，图乙和图丙表示进行重组质粒时对于限制酶的选取。 3、灭菌的方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌，灼烧灭菌用于接种用的金属工具；干热灭菌用于能耐高温的，需要保持干燥的玻璃器皿等；高压蒸汽灭菌用于培养基等。 【详解】（1）实验人员对马铃薯去皮切块后高压煮沸，主要目的是灭菌（或防止杂菌污染）；该培养基的碳源主要包括马铃薯中的淀粉和加入的葡萄糖；用于装培养基的培养皿一般用干热灭菌法进行灭菌处理。 （2）啤酒在工业化生产过程中，发酵过程分为主发酵和后发酵两个阶段。酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代谢物的生成都在主发酵阶段完成。主发酵结束后，发酵液还不适合饮用，要在低温、密闭的环境下储存一段时间进行后发酵，这样才能形成澄清、成熟的啤酒。 （3）①在PCR反应体系中需加入缓冲液、引物、4种脱氧核苷酸、含目的基因的DNA模板以及耐高温的DNA聚合酶。根据目的基因的一条链可以推出另一条链两端的序列，根据引物的5'端对应模板链的3'端，可推出两条引物的序列分别为：5'－GGCATG－3'和5'－ATTCCA－3'。 ②根据图丙可知，EcoRV的限制酶切点在目的基因内部，若用其获取目的基因会破坏目的基因，切割目的基因和质粒的限制酶应该是相同的，以保证有相同的黏性末端，因此应该选择的最好酶切位点是BamHl和EcoRⅠ。分别使用BamH I和EcoR Ⅰ限制酶切割，质粒和目的基因两端不会形成相同黏性末端，在连接酶的作用下不会发生自身环化，还可以防止反向连接，最终在连接酶的作用下只会出现目的基因与质粒成功重组和没有进行重组的质粒，此外，还有利于筛选出含有目的基因的受体细胞。 ③由于构建重组质粒时，BamH I会破坏质粒中的四环素抗性基因，因此若在添加卡那霉素和四环素的培养基中有少量菌落，则说明这些菌落不含目的基因。 23．（2024·山东菏泽·二模）由P基因编码的P蛋白是一种水通道蛋白，该蛋白在植物调节水分吸收方面发挥着重要作用。科研人员成功培育出超量表达P蛋白的转基因玉米。培育过程中所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图1所示。 (1)构建基因表达载体时，切割Ti质粒应选用 酶。从切割DNA片段和Ti质粒到构建基因表达载体完成共需 种酶。 (2)将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入 （填“潮霉素”、“卡那霉素”或“潮霉素或卡那霉素”）进行筛选，理由是 。筛选出的愈伤组织最终培养成转基因玉米。 (3)农杆菌转化法除了用于获取转基因植物外，还可以通过T-DNA插入基因内部使基因沉默，获得突变体。为了获得mm突变体，某科研小组利用野生型MM，通过农杆菌转化法使基因M沉默。由于T-DNA插入的位置是随机的，为确定T-DNA是否插入M基因中，该小组采用“三引物法”进行PCR扩增，即采用三种引物（LP、RP、BP），LP、RP为与目的基因片段互补的特异引物，BP为插入T-DNA的特异引物，如图所示。（说明：T-DNA插入基因后，会阻止被插入基因两端引物的扩增产物的形成）根据下表中三种样品的电泳结果判断样品 是纯合突变体，理由是 。 引物种类样品序号 LP+RP BP+RP 样品1 有大片段 无 样品2 有大片段 有小片段 样品3 无 有小片段 【答案】(1) EcoRⅠ和SpeⅠ酶 5 (2) 潮霉素 潮霉素基因位于T-DNA中，会与目的基因一同转移到玉米愈伤组织细胞的染色体上 (3) 3 样品1表现为能合成大片段，其基因型为MM，样品3中插入了T-DNA片段，表现为无扩增大片段出现，其基因型可表示为mm。 【分析】基因工程技术的基本步骤： (1) 目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 (2) 基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 (3) 将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 (4) 目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）构建基因表达载体时，切割目的基因需要用到的限制酶为MunⅠ和XbaⅠ，结合各种限制酶的识别序列可知，EcoRⅠ和SpeⅠ分别和MunⅠ和XbaⅠ为同尾酶，因此，切割Ti质粒应选用EcoRⅠ和SpeⅠ酶。从切割DNA片段和Ti质粒到构建基因表达载体完成共需四种限制酶和一种DNA连接酶，共需要5种酶。 （2）将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入潮霉素进行筛选，因为潮霉素基因位于T-DNA中，会与目的基因一同转移到玉米愈伤组织细胞的染色体上，因此凡是成功导入目的基因的愈伤组织细胞应该具有对潮霉素的抗性。进而用筛选出的愈伤组织最终培养成转基因玉米。 （3）农杆菌转化法除了用于获取转基因植物外，还可以通过T-DNA插入基因内部使基因沉默，获得突变体。为了获得mm突变体，某科研小组利用野生型MM，通过农杆菌转化法使基因M沉默。由于T-DNA插入的位置是随机的，为确定T-DNA是否插入M基因中，该小组采用“三引物法”进行PCR扩增，即采用三种引物（LP、RP、BP），LP、RP为与目的基因片段互补的特异引物，BP为插入T-DNA的特异引物，如图所示。结合题图是以及题目信息可知，样品1没有插入相应的T-DNA片段，其基因型为MM，样品3中插入了T-DNA片段，表现为无扩增大片段出现，其基因型可表示为mm，而样品2的基因型可表示为Mm。即根据下表中三种样品的电泳结果判断样品3是纯合突变体。 24．（2024·山东临沂·二模）滚环扩增技术（RCA）是借鉴自然界中病原生物体环状DNA分子滚环式复制方式发展起来的一种核酸扩增方法，在致病菌、核酸肿瘤标记物、蛋白质、生物小分子和病毒检测领域有着广泛应用。图1为RCA原理示意图。具核梭杆菌为一种强粘附性消化道细菌，侵入肠黏膜后可诱导局部炎症和细胞因子的表达增加，导致结直肠肿瘤的形成。科研人员采用基于RCA的荧光标记滚环扩增检测方法，实现了在微量样品及复杂环境下的高灵敏度、高特异性的检测。图2为荧光标记滚环扩增检测过程示意图，过程②是使锁式探针环化的过程。其中nusG基因为具核梭杆菌的特异性基因，锁式探针为依据nusG基因序列设计出来的单链DNA分子，由两端的检测臂和无关序列组成。只有当环境中存在靶核酸序列时，锁式探针才能完成成环连接反应。检测探针中的荧光基团（FAM）距离淬灭基团（BHQ-1）比较近时，荧光会被淬灭。    (1)由图1推测，Phi29DNA聚合酶的作用是 。与常规PCR相比，RCA缺乏 环节，因此可推测RCA扩增过程中使用的Phi29DNA聚合酶不具有 的特性。 (2)过程②锁式探针完成成环连接反应需要 的催化。肠道中含有多种微生物，为保证检测的特异性，在设计锁式探针时需保证 ，同时还需注意无关序列中不含 。 (3)若检测样品存在具核梭杆菌，检测探针中荧光基团发出荧光的原理是 。该检测方法具有高灵敏度的原因是 。 【答案】(1) 能既需催化磷酸二酯键的形成，也能催化氢键的断裂 变性 耐高温 (2) DNA连接酶 检测臂中含nusG基因的特异性序列 其它微生物的特异性碱基序列 (3) 长重复单链DNA与检测探针特异性结合，导致探针两端的FAM与BHQ-1距离增大，发出荧光 长重复单链DNA中可同时结合多个检测探针，从而使荧光强度增加 【分析】PCR是体外模拟DNA复制的过程，其原理是DNA双链复制。体内DNA复制过程中需要模板、原料、能量、引物和酶等，PCR过程中原料和能量由dNTP提供，酶是热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。 【详解】（1）由图1可知，以单链环状DNA为模板可在Phi29DNA聚合酶作用下形成滚动形成长重复单链DNA，说明Phi29DNA聚合酶既需催化磷酸二酯键的形成，也需催化氢键的断裂；由于模板是单链DNA，因此扩增时不需要解旋形成单链，故与常规PCR相比，RCA缺乏变性环节，即该扩增过程不需要在高温条件下进行，因此可说明RCA扩增过程中所使用的Phi29DNA聚合酶不具有耐高温特性； （2）过程②为锁式探针进行连接以实现环化，即在nusG基因一条链与锁式探针碱基互补配对的前提下，通过DNA连接酶形成磷酸二酯键将锁式探针连接形成环状，因此②过程中需要的酶是DNA连接酶；在设计锁式探针时需保证检测臂中含nusG基因的特异性序列，同时还需注意无关序列中不含其它微生物的特异性碱基序列，防止扩增的长重复单链中含有其它微生物的特定碱基序列； （3）若检测样品存在具核酸杆菌，经图2中②-④过程得到的长重复单链DNA与检测探针特异性结合，导致探针两端的FAM与BHQ-1距离增大，发出荧光；由于长重复单链DNA中可同时结合多个检测探针，从而使荧光强度增加，因此提高了该检测方法的灵敏度。 25．（2024·山东济宁·三模）PCR技术的实用性和极强的生命力其使成为生物科学研究的一种重要方法，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。下面是两个具体实验中的PCR技术应用，请根据资料回答下列问题： (1)重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。利用该技术可以实现基因的定点诱变。它在需要诱变的位置合成两个带有变异基因碱基的互补引物，然后分别与引物a和引物d做PCR，这样得到的两个PCR引物产物都带有变异基因，并且彼此重叠，再将重叠部位进行重组PCR就能得到诱变PCR产物，如图所示： ①PCR扩增DNA的过程中，引物a、b、c、d中，PCRI应选择图1中引物 ，大量扩增突变产物AD则应选择引物 。 ②重叠延伸PCR通过 实现定点突变。PCR1和PCR2需要分别进行的原因是 。 ③若正常基因可被限制酶DpnI识别并切割，特定位点突变后的基因不能被DpnI识别，请设计实验思路鉴定上述过程获得的突变产物AD是否为突变基因： 。 (2)反向PCR可用于扩增未知序列，其原理如下图所示。下图链状DNA分子内侧是已知序列，外侧为未知序列。 ①不直接在图2中DNA分子的两端设计引物并进行扩增，原因是 。 ②图3中环状DNA进行PCR的过程中，沿引物A延伸子链的延伸方向是 （填“顺时针”或“逆时针”），PCR产物 （填“含有”或“不含”）EcoRI的酶切位点。 【答案】(1) a和b a和d 在引物b和c上引入突变 引物b和引物c可以互补配对，导致引物失效 用限制酶DpnI分别处理正常基因和上述过程获得的突变产物AD，然后进行电泳；若上述过程获得的突变产物AD的电泳条带只有一条且大于正常基因的电泳条带，则为突变基因 (2) DNA两端序列未知，无法设计引物 逆时针 含有 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。 【详解】（1）①PCR扩增DNA的过程中，新合成的两条单链延伸方向相反，根据图中引物的方向可知，PCR1应选择引物a和b，得到产物AB。PCR2应选择引物c和d，得到产物CD。突变产物AD扩增选择的引物是a和d。重叠延伸时，可以分别以AB上链和CD下链为引物进行延伸，所以不需要引物。 ②重叠延伸PCR通过在引物b和c上引入突变实现定点突变，引物b和c分别和第一代DNA的两条单链的对应碱基互补，则其上的突变位点的碱基应互补配对。由于引物b和引物c可以互补配对，导致引物失效，所以PCR1和PCR2需要分别进行。 ③据题意可知，若正常基因可被限制酶DpnI识别并切割，特定位点突变后的基因不能被DpnI识别，因此要鉴定获得的突变产物AD是否为突变基因，实验设计思路为：用限制酶DpnI分别处理正常基因和上述过程获得的突变产物AD，然后进行电泳；若上述过程获得的突变产物AD的电泳条带只有一条且大于正常基因的电泳条带，则为突变基因。 （2） ①利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列作为引物，由于该DNA分子两端的脱氧核苷酸序列未知，故无法设计引物，所以不能直接在图1中DNA分子的两端设计引物并进行扩增。 ②据图中未知序列的位置可知，图3中环状DNA进行PCR的过程中，沿引物A逆时针延伸子链，沿引物a顺时针延伸子链，才能扩增到未知序列，由于碱基互补配对，环化后的DNA分子含有EcoRI的切割位点，则PCR产物含有EcoRI的酶切位点。 26．（2024·山东济南·模拟预测）雄性不育植株可简化育种流程，是杂交育种的重要材料。研究发现利用油菜纯合的雄性不育植株甲做母本与野生型杂交，后代均可育，但总会出现部分白化幼苗长到成体死亡。为研究相关机制，提高育种效率，科研人员进行了相关实验。 (1)植株甲中存在雄性不育基因A’，导致雄蕊不能发育。实验发现甲与油菜品系丙杂交，后代均可育，且不出现白化现象。科研人员将甲与野生型杂交所得存活的F1与甲、丙杂交得到的F1杂交，发现子代中雄性可育幼苗占比为 ，进而推测丙产生了新的显性突变基因(记作B)，使雄性不育基因A’导致的不育性状得以恢复，且两基因位于非同源染色体上。 (2)为研究A’、B基因与白化性状的关系，科研人员进行如下实验。 ①从油菜中分离A’、B基因，将A'基因导入拟南芥(拟南芥不含与A’、B同源的基因)，筛选得到至少插入一个外源基因的转基因植株TA群体。将B基因转入拟南芥，经筛选获得纯合子TB．设计杂交实验，检测存活F1的基因组成，杂交组合及结果如下表。 组号 杂交组合 存活的F1 成体总数 含A’成体数 不含A’成体数 一 ♀TA群体×♂野生 630 95 535 二 ♀TA群体×♂TB 607 415 192 据实验结果推测，A’基因引起部分子代死亡，B基因可抑制A’基因的作用，依据是 。二组F1中含有A’的植株比例超过1/2的原因 。 ②植物中核蛋白N与叶绿体发育有关。新的研究发现，基因A’的表达产物可与核蛋白N形成复合体。科研人员推测，基因B通过抑制A’基因的表达而解除A’对N的影响。为证明该推测，请完成下列实验设计。 实验材料 操作 观察指标 野生型拟南芥 导入A’基因 叶绿体发育情况 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ a.导入A’基因   b.导入B基因   c.导入A’、B基因   d.野生型拟南芥   e.N缺失突变拟南芥 观察指标Ⅰ～Ⅳ应依次填写 (填写选项前字母)。 (3)B基因突变如下图1所示： 为了检测某个体基因型，研究人员拟用PCR扩增该基因，再用某限制酶(识别序列及切割位点如图2所示)完全酶切。设计了一条引物为5’-GGCATG-3’，另一条引物为 (写出6个碱基即可)。用上述引物扩增基因片段后，其酶切产物长度可能为 bp(注：该酶切位点在目的基因片段中唯一)。再对酶切产物通过 的方法检测，可以确定该个体基因型。 【答案】(1)7/8 (2) 第一组F1含A’的成体数远小于不含A’的成体数，第二组F1中含A’基因成体的比例高于第一组 TA群体中存在插入多个A’基因的个体，产生含有A’的配子比例大于1/2 c、e、a、c (3) 5′-ATTCCA-3′ 302、8、310 电泳 【分析】自由组合定律: 控制不同性状的遗传因子的分离和组合是互不干扰的; 在形成配子时,决定同一性状的成对的遗传因子彼此分离,决定不同性状的遗传因子自由组合。 【详解】（1）植株甲中存在雄性不育基因A'，甲的基因型可表示为A'A'bb。实验发现甲与油菜品系丙（AABB）杂交，后代均可育，且不出现白化现象。科研人员将甲与野生型杂交所得存活的F1(A'Abb)与甲、丙杂交得到的F1(A'ABb)杂交，发现子代中雄性不育且白化幼苗所占的比例为1/4×1/2=1/8，则雄性可育幼苗占比7/8，进而推测丙产生了新的显性突变基因（记作B），使雄性不育基因A'导致的不育性状得以恢复，且两基因位于非同源染色体上。 （2）①实验结果显示，杂交组合一产生的F1中，含有A'基因的个体只有95个个体存活，而不含A'基因的个体有535个个体存活，此时含A'基因的成活率约为1/6，说明A'基因的存在导致成活率下降，同时杂交组合二中，含有A'基因同时含有基因B的个体数目为415，而含有A'基因不含B基因的个体数目为192，说明B基因可抑制A'基因的作用。二组F1中含有A'的植株比例超过1/2的原因可能是TA群体中存在插入多个A’基因的个体，产生含有A’的配子比例大于1/2。 ②植物中核蛋白N与叶绿体发育有关。新的研究发现，基因A'的表达产物可与核蛋白N形成复合体。本实验的目的是验证基因B通过抑制A'基因的表达而解除A'对N的影响，因此实验的自变量为导入基因的种类，因变量是叶绿体的发育情况，因此实验表格中依次导入的基因应该为Ⅰ、c导入A'、B基因；Ⅱ中的材料为N缺失突变拟南芥；Ⅲ、a导入A'基因；Ⅳ、 c、导入A'、B基因。 （3）由图示可知，某个体兼有正常B基因和突变B基因。考虑引物方向，扩增引物碱基序列应与正常B基因双链与突变B基因双链共有的TAAGGT序列（图中两条链的互补链）互补配对，即另一条引物为5′-ATTCCA-3′。从而扩增出大量正常B基因和突变B基因供后续鉴定。由酶切位点和题中所给引物与目的基因结合的起始点可推知，正常B基因酶切后片段为ATTCCAGA共8bp和TC+293个碱基+CCATGCC共302bp。该酶切位点在目的基因片段中是唯一的，突变B基因无法被酶切断。后续可通过电泳等手段区分开，达到检测B因突变情况的目的，即最终酶切产物长度应为302、8、310三种。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。对酶切产物通过电泳的方法检测。 27．（2024·山东德州·二模）抗菌肽是一类广泛存在于自然界中的多肽，对细菌、真菌、寄生虫和病毒具有广泛的抑制作用。科研人员将抗菌肽Piscidin基因及NK-lysin基因进行融合形成杂合肽NK-LPd基因（部分过程如图1所示），从而获得具有更高抗菌活性的杂合抗菌肽。   (1)DNA聚合酶能够从引物的 （填“3´”或“5´”）端开始连接脱氧核苷酸。若设计的引物较长，为提高PCR的准确度需要适当 （填“提高”或“降低”）复性温度。 (2)Piscidin基因表达以a链为模板，NK-lysin基因表达以d链为模板。为了实现图1中两基因重叠延伸，PCR1过程中需要分别在引物 和引物 的5´端添加互补序列。 (3)图2为PCR1扩增产物（Ⅰ、Ⅱ）和PCR2扩增产物（Ⅲ）的凝胶电泳实验结果，根据结果可说明基因融合成功，判断依据是 。   (4)在转化前，需要先构建含NK-LPd基因的表达载体，其目的是 ；在成功转化的酵母菌中提纯得到杂合抗菌肽NK-LPd，为验证NK-LPd对大肠杆菌的抑菌效果，先将大肠杆菌涂布在图3的平板上，再放置滤纸片。根据图示实验结果推测，在A、D区域放置的滤纸片分别为 。   【答案】(1) 3´ 提高 (2) X Z (3)Ⅰ、Ⅱ的长度之和与Ⅲ基本相等 (4) 使融合基因能够在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代，且使融合基因表达和发挥作用 空白滤纸片、含杂合抗菌肽NK-LPd的滤纸片 【分析】PCR技术进行的条件有：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定性的DNA聚合酶，所运用的原理为DNA分子的复制，遵循碱基互补配对原则。 【详解】（1）DNA聚合酶在DNA复制过程中，从引物的3’端 开始连接脱氧核苷酸，因为DNA聚合酶只能催化脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸片段的3'羟基上。如果设计的引物较长，那么引物与模板之间的结合会更加稳定，因此需要适当提高复性温度，以确保引物与模板之间的特异性结合。 （2）已知Piscidin基因表达以a链为模板，NK-lysin基因表达以d链为模板，而在PCR扩增时，引物会与模板链的3´结合，沿着5´→3´方向延伸，所以为了实现图1中两基因重叠延伸，PCR1过程中需要在引物X和引物Z的5端添加互补序列，这是因为融合基因中两个基因的模板链应在同一条DNA单链中。 （3）图2为PCR1扩增产物（Ⅰ、Ⅱ）和PCR2扩增产物（Ⅲ）的凝胶电泳实验结果，根据结果可说明基因融合成功，判断依据是Ⅰ、Ⅱ的长度之和与Ⅲ基本相等。 （4）在转化前，需要先构建含NK-LPd基因的表达载体，其目的是使融合基因能够在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代，且使融合基因表达和发挥作用；在成功转化的酵母菌中提纯得到杂合抗菌肽NK-LPd，为验证NK-LPd对大肠杆菌的抑菌效果，先将大肠杆菌涂布在图3的平板上，再放置滤纸片，根据抑菌圈大小可以判断抑菌效果的强弱，在图3中A区域未出现抑菌圈，推测放置的滤纸片为空白滤纸片，D区域抑菌圈最大，根据题干信息可知，将抗菌肽Piscidin基因及NK-lysin基因进行融合形成杂合肽NK-LPd基因，从而获得具有更高抗菌活性的杂合抗菌肽，所以推测D区域放置的滤纸片为含杂合抗菌肽NK-LPd的滤纸片。 28．（2024·山东青岛·二模）某种雄性不育水稻是由野生型水稻的核基因M突变为m所致，科研团队构建转基因智能不育系的思路是：将育性恢复基因OsNP1（在原始生殖细胞中表达）、花粉失活基因ZM-AA（在花粉中表达）两个基因一起构建重组Ti质粒。然后通过农杆菌转化法将目的基因导入愈伤组织细胞，从转基因后代中筛选m位点是纯合的但是两个转基因位点是杂合的可育植株。 (1)图1为已导入ZM-AA基因的重组Ti质粒，图2为OsNP1基因和相应的酶切位点，其中A链为转录模板链。为使OsNP1基因与图1中Ti质粒正确连接来构建基因表达载体，应选择的酶有 ；采用PCR技术扩增图2中的OsNP1基因时，会出现长、中、短三种长度的单链，一个OsNP1基因在第n次循环中新合成的短链数为 。 (2)重组Ti质粒中的新霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因的具体作用分别是 、 。 (3)若使两个基因分别在不同的细胞中表达，需将两个基因分别与 重组在一起。 (4)在不考虑其他变异的情况下，筛选出的杂合体转基因植株自交后代会出现 种基因型。从转基因安全性的角度分析，构建此转基因智能不育系的优点是 。 【答案】(1) BamH Ⅰ、Hind Ⅲ和DNA连接酶 2n-2 (2) 筛选出导入目的基因的愈伤组织细胞 筛选出导入重组Ti质粒的农杆菌 (3)在特定细胞中特异性表达的基因启动子等调控元件 (4) 2/两 防止目的基因通过花粉扩散而出现基因污染 【分析】将目的基因导入受体细胞，根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、和花粉管通道法等；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 【详解】（1）图1重组Ti质粒的启动子和终止子之间含有三种酶，即EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、Hind Ⅲ，而图2 OsNP1基因两端的酶切位点为EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、Hind Ⅲ，由于EcoR Ⅰ 酶切会导致目的基因或重组质粒环化或自连，且目的基因反向连接，为使OsNP1基因与图1中Ti质粒正确连接来构建基因表达载体，应选择的酶是BamH Ⅰ、Hind Ⅲ和DNA连接酶；PCR技术扩增会出现长、中、短三种长度的单链，分别代表模板链、引物链（第一次扩增形成的），新合成的短链；一个OsNP1基因在n-1次循环，形成2n-1个DNA分子、形成2n个DNA链，而这些链中只有模板链不会新合成短链，则第n次循环中新合成短链的数目=2n-2。 （2）新霉素抗性基因的作用是作为标记基因，用于筛选含有目的基因的受体细胞（愈伤组织细胞）；卡那霉素抗性基因的作用是作为选择标记基因，用于筛选含有重组Ti质粒的农杆菌。 （3）若使两个基因分别在不同的细胞中表达，需将两个基因分别与在特定细胞中特异性表达的基因启动子等调控元件重组在一起。 （4）题干信息获取的是m位点是纯合的但是两个转基因位点是杂合的可育植株，杂合体转基因植株自交时，能产生两种基因型的卵细胞，由于含有育性恢复基因OsNP1（在原始生殖细胞中表达）、花粉失活基因ZM-AA（在花粉中表达）两个基因，育性恢复基因OsNP1在原始生殖细胞中表达，该杂合子能产生正常的精原细胞，花粉失活基因ZM-AA在花粉中表达，所以含有转基因的花粉失活，只含有m的花粉正常，即只形成一种雄配子，故杂合子自交后代会出现2种基因型。从转基因安全性的角度分析，构建此转基因智能不育系的优点是防止目的基因通过花粉扩散而出现基因污染。 29．（2024·山东威海·二模）营养期杀虫蛋白（Vip3Aa）是苏云金芽孢杆菌在营养生长阶段产生的一种新型杀虫蛋白，对许多鳞翅目害虫具有较强的杀虫活性。研究人员以鳞翅目害虫草地贪夜蛾为模型，筛选获得了与Vip3Aa抗性相关的基因（Sfmyb基因）。 (1)研究人员首先采用RNA干扰（RNAi）技术使草地贪夜蛾体内部分Sfmyb基因沉默，发现幼虫对Vip3Aa的敏感性显著降低，由此说明Sfmyb基因与Vip3Aa抗性的关系是 。 (2)研究人员通过启动子活性实验发现草地贪夜蛾抗性品系中Sfmyb基因启动子的活性低于敏感品系。由此推测，Vip3Aa抗性的产生可能是由于Sfmyb基因启动子活性下调后影响 ，从而改变了Sfmyb基因的转录水平。进一步研究发现，抗性品系中Sfmyb基因启动子发生了多个位点的突变和缺失。与敏感品系相比，抗性品系中Sfmyb基因控制合成的蛋白质的氨基酸序列 （填“发生”或“不发生”）改变，原因是 。 (3)进一步研究发现，Sfmyb基因的表达产物转录因子myb（能识别特定DNA序列并与之结合）可调控下游祀标基因的农达水平从而导致抗性性状的出现。研究人员采用反向酵母单杂交技术对某待测基因是否是myb的靶标基因进行鉴定，具体操作步骤为： ①采用PCR技术扩增待测基因，再将待测基因插入下图结构N所示的启动子上游，构建基因表达载体1，将Ⅰ导入营养缺陷型酵母菌中。 ②将Sfmyb基因和AD基因（能表达出转录激活蛋白AD）融合后构建基因表达载体Ⅱ.将其转入上述转基因酵母菌中，融合基因表达出的转录因子myb和AD组合成复合蛋白，当myb能识别待测基因并与之结合时，AD便发挥转录激活活性，诱导下游组氨酸合成基因和色氨酸合成基因表达。 ③将上述转基因酵母菌接种到特定的固体培养基上培养，观察是否有菌落产生。 步骤①中，PCR扩增待测基因时加入的引物需满足的条件是 ；为确定结构N中待测基因插入方向正确，采用PCR技术检测时，应选择上图中的引物 。步骤③中。特定的固体培养基是指 ；若观察到培养基中有酵母菌菌落分布，则说明 ，得出上述结论的依据是 。 【答案】(1)Sfmyb基因表达产物减少可增强对Vip3Aa的抗性 (2) RNA聚合酶与启动子的识别和结合 不发生 Sfmyb基因编码蛋白质的碱基序列中不包含启动子序列 (3) 能与待测基因母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 F1与R1（或“F2和R2”） 不含组氨酸和色氨酸的固体培养基 待测基因是myb（Sfmyb基因表达产物）的靶标基因 只有待测基因是myb的靶标基因，myb才能与之结合，AD才能发挥转录激活活性，诱导下游的组氨酸合成基因和色氨酸合成基因表达合成组氨酸和色氨酸，营养缺陷型酵母菌才能在缺少组氨酸和色氨酸的培养基上生长形成菌落 【分析】基因工程技术的基本步骤: (1)目的基因的获取:方法有从基因文库中获取、利用PCR技 术扩增和人工合成。 (2)基因表达载体的构建:是基因工程的核心步骤，基因表达 载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 (3)将目的基因导入受体细胞:根据受体细胞不同，导入的方 法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化 法、基因枪法和花粉管通道法;将目的基因导入动物细胞最有 效的方法是显微注射法;将目的基因导入微生物细胞的方法是 感受态细胞法。 (4)目的基因的检测与鉴定:分子水平上的检测;个体水平上 的鉴定:抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）RNA干扰技术使草地贪夜蛾体内部分Sfmyb基因沉默，即Sfmyb基因表达产物减少，结果使幼虫对Vip3Aa的敏感性显著降低，也就是增强了对Vip3Aa的抗性。 （2）实验发现草地贪夜蛾抗性品系中Sfmyb基因启动子的活性低于敏感品系。由此推测，Vip3Aa抗性的产生可能是由于Sfmyb基因启动子活性下调后影响RNA聚合酶与启动子的识别和结合，从而改变了Sfmyb基因的转录水平。进一步研究发现，抗性品系中Sfmyb基因启动子发生了多个位点的突变和缺失。与敏感品系相比，抗性品系中Sfmyb基因控制合成的蛋白质的氨基酸序列不发生改变，原因是Sfmyb基因编码蛋白质的碱基序列中不包含启动子序列。 （3）PCR扩增中的引物需满足的条件是能与待测基因母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸；为将待测基因插入结构N所示的启动子上游，根据结构N中启动子的位置和引物的箭头指示，采用PCR技术检测时，应选择图中的引物F1与R1（或“F2和R2”）。因结构N中有组氨酸合成基因和色氨酸合成基因，所以可将转基因酵母菌接种到不含组氨酸和色氨酸的固体培养基上进行筛选，若观察到培养基中有酵母菌菌落分布，则说明待测基因是myb（Sfmyb基因表达产物）的靶标基因，因为只有待测基因是myb的靶标基因，myb才能与之结合，AD才能发挥转录激活活性，诱导下游的组氨酸合成基因和色氨酸合成基因表达合成组氨酸和色氨酸，营养缺陷型酵母菌才能在缺少组氨酸和色氨酸的培养基上生长形成菌落。 【点睛】本题考查基因工程的相关知识，意在考查学生的识记能力和判 断能力、运用所学知识综合分析问题的能力。 30．（2024·山东烟台·三模）研究人员拟培育转fat1基因和fat2基因的转双基因猪，为避免fat1蛋白和fat2蛋白相互融合影响功能，利用重叠延伸PCR技术在fat1基因和fat2基因之间插入具有自剪切功能的2A连接肽基因，构建fatl-2A-fat2融合基因。2A基因的转录产物可通过“核糖体跳跃”断开位于2A肽尾端甘氨酸（G）和脯氨酸（P）之间的肽键，将2A基因编码的蛋白分割成2个独立蛋白。图甲表示利用重叠延伸PCR技术成功构建融合基因的过程。图乙表示构建成功的包含融合基因的重组质粒的部分片段，F1～F4、R1～R4表示引物。    (1)利用PCR技术可实现在体外快速大量扩增DNA，其与细胞内DNA复制的共同点是 （答出2点）。若图乙中融合基因的b链为模板链，则图甲PCR1中的引物甲与图乙中的引物 的绝大部分序列相同。 (2)PCR1和PCR2需要分开单独进行，原因是 。PCR3不需要引物，高温加热后fat1—2A和2A—fat2的双链解开，其中能正常延伸形成融合基因的是 （填序号）形成的杂交链。 (3)图乙构建的重组质粒中未标注出的必需元件还有 。为确定fat1基因连接到重组质粒中且插入2A序列的上游，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图乙中的引物 。所融合基因经下图中的过程表达产生fat1和fat2两种蛋白，经检测发现通过该技术表达的fat1蛋白较正常fat1蛋白的分子量大，据该融合基因的结构和表达原理推测，原因是 。    【答案】(1) 都需要模板、引物、DNA聚合酶、原料都是脱氧核苷酸 R4 (2) 引物甲和引物丁部分碱基互补配对,影响子链的合成 ①、④ (3) 复制原点、标记基因 F1、R3 fatl基因后面连接了2A序列,使fat1蛋白后面连接了2A肽的部分片段 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）PCR技术与细胞内DNA复制的共同点是都需要模板、引物、DNA聚合酶、原料都是脱氧核苷酸； 若图乙中融合基因的b链为模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链(也就是a链)是5'-3';考虑到DNA复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中fat1片段中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故图甲PCR1中的引物甲与图乙中的R4链相应部分的序列相同； （2）利用重叠延伸PCR连接fat1和fat2基因过程中引物2和引物3的侧翼序列是互补配对的，若置于同一反应体系，会发生结合而失去作用，不能扩增目的基因，因此PCR1体系与PCR2体系应分别独立进行；因PCR扩增过程中，子链延伸方向只能由5'到3'端延伸，因此高温加热后fatl—2A和2A—fat2的双链解开，其中能正常延伸形成融合基因的是①、④形成的杂交链。 （3）基因表达载体中需要由启动子、终止子、标记基因、复制原点和目的基因，图乙中含有启动子、终止子、融合基因（目的基因），因此图中未标注出的元件还有复制原点和标记基因；为了确定fatl基因连接到质粒中且插入2A序列的上游，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图乙中的引物F1、R3 ，若fat1基因插入到2A基因下游，该对引物无法扩增出DNA序列；由图可知， 同一对启动子和终止子之间，fatl基因后面连接了2A序列，使fat1蛋白后面连接了2A肽的部分片段，因此该技术表达的fat1蛋白的分子量较正常fat1蛋白的分子量大。 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！12 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$