备课素材：单倍体胚胎干细胞与半克隆技术-2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3

单倍体胚胎干细胞与半克隆技术 先看一道试题： 李劲松研究团队建立了小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞，并且能让这一细胞替代精细胞使雌鼠产生的卵细胞“受精”，生产出半克隆小鼠。孤雄单倍体胚胎干细胞系构建方式如下：精卵细胞结合排出第二极体后，在核融合之前，剔除卵母细胞的雌原核，诱导、培养。下列说法错误的是 A.受精卵发育过程中桑椹胚前的细胞都是全能性细胞 B.推测Oct4基因的表达有利于延缓衰老 C.过程③胚胎干细胞细胞核大、核仁明显 D.从卵巢中获取的卵母细胞可直接用过程① 解析：A、桑椹胚前细胞只分裂不分化，属于全能性细胞，A正确；B、题干中说明其只能在维持胚胎干细胞全能性和自我更新中起作用，不能维持其它干细胞的自我更新，故不能延缓衰老，B错误；C、胚胎干细胞是早期胚胎或原始性腺中分离出来的一种细胞，形态上为体积较小、细胞核大、核仁明显，C正确；D、获得的卵母细胞应为次级卵母细胞中期的细胞，已无细胞核，D错误。故选：BD。 此题情境材料“孤雄单倍体胚胎干细胞“与“半克隆”教材没有提到。 那么，什么是孤雄单倍体？有哪些应用？ 在哺乳动物中，细胞主要以二倍体核型存在，只有通过减数分裂产生的精子和卵子是单倍体。精子和卵子通过精卵结合之后又以二倍体胚胎的形式起始发育。在演化的过程中，二倍体核型的出现能够有效防止有害突变，维持物种的稳定性，增加物种的遗传多样性。但二倍体由于存在两套染色体，在发生隐性基因突变时无法直接观察到相应的表型，因此不利于进行基因筛选和基因功能性研究。生殖细胞虽然是单倍体核型，但由于处在终末分化的状态，无法在体外进行增殖培养。虽然精子介导的转基因（sperm-mediated gene transfer，SMGT）技术能够将外源的DNA序列通过受精导入到胚胎中，产生转基因个体，但产生的转基因小鼠效率低下，且外源基因的整合位点有不可预测性。 单倍体胚胎干细胞的建立解决了以上的问题。首先，单倍体胚胎干细胞中只有一套染色体，显著降低了基因组的复杂性，能够作为基因功能研究和遗传筛选的有力工具。其次，孤雄单倍体胚胎干细胞（androgenic haploid embryonic stem cells， AG-haESCs）可以作为精子的替代物，将编辑的基因和基因编辑器通过“授精”传递到胚胎中，实现复杂和精准基因编辑个体的快速制备。 一.AG-haESCs可作为精子的替代物产生健康半克隆小鼠 基因功能的研究依赖于基因改造动物模型的构建，而后者往往需要通过细胞作为载体将改造过的基因传递到胚胎中，进而形成个体。精子通过受精可以产生胚胎，因此被认为是携带遗传改造和基因编辑器的有效工具。 1.精子介导的基因编辑：1971年，有研究报道精子细胞能够携带外源的基因组通过受精产生转基因的个体。但是这个发现一直被忽略，直到1989年的时候，又有研究组对此现象重新进行报道。研究人员将外源的DNA序列与成熟的小鼠精子细胞一起静置在等渗的溶液中，再通过体外受精的方式将带有外源DNA序列的精子注入到卵细胞中，最终产生了具有生殖能力的转基因小鼠。在此之后，SMGT技术开始发展起来。由于SMGT技术简单和成本低，该技术在全世界快速地流行起来。该技术被广泛应用于各个类型的物种中，证实精子确实能够携带外来的基因进入卵细胞中用于构建转基因个体。 但是SMGT的效率和结果在实验中仍然是不可预测的。精子是终末分化、不可分裂的细胞，因此在受精前选择携带完整外源DNA的精子是十分困难的，必须产生大量的F0代小鼠用于鉴定获得携带外源基因的个体；外源DNA序列也可能保持在染色体外，而不是稳定地整合到宿主基因组中，因此虽然在F0代和F1子代中证实了转基因的存在，外源的转基因可能会通过非孟德尔定律遗传，呈现出嵌合体的分布，甚至在细胞连续分裂后，转基因会发生丢失。虽然SMGT并不是用于制备转基因的可靠工具，但对于应用精子或者精子的替代物进行基因编辑制备转基因小鼠有一定的启发性。 2.小鼠精原干细胞（spermatogonial stem cells，SSCs）介导的基因编辑：SSCs是具有自我更新和分化能力的生殖干细胞。在成年的雄性小鼠中，SSCs是产生精子的唯一来源。基于对小鼠SSCs自我更新机制的理解，Shinohara等［7］在2003年建立了小鼠SSCs培养体系。将体外培养超过两年的SSCs移植回到小鼠的睾丸中，SSCs生精的能力没有明显的差别，说明体外长时间的培养对于SSCs的功能不会产生显著的影响。 小鼠SSCs的体外培养和体内移植方法的建立使得SSCs中的基因编辑成为了可能。在SSCs中通过慢病毒感染或者转染导入外源基因，最后将携带遗传修饰的SSCs移植回不育小鼠，通过繁育能够产生目的转基因小鼠。2005年，Kanatsu-Shinohara等将带有Neo抗性的质粒转染进SSCs，应用G418筛选到了带有Neo抗性的SSCs。将稳定表达Neo抗性的SSCs移植回了小鼠体内，最终能够产生约50%的转基因小鼠后代。结合最新的基因编辑技术SSCs还可以用于遗传疾病的治疗。2014年，Wu等利用CRISPR-Cas9技术在小鼠的SSCs中修复了白内障遗传缺陷，产生了完全健康的后代。2021年，Wang等结合CRISPR-Cas9和SSCs治疗了雄性不育。Tex11PM/Y突变会导致减数分裂异常，产生无精的症状。研究人员首先建立Tex11PM/Y突变的小鼠，进而获得其SSCs，并利用CRISPR-Cas9对Tex11PM/Y突变的SSCs进行修复。通过体外检测，将修复正常的SSCs移植回不育小鼠，最终能够产生健康可育的后代。 但是SSCs体外培养过程中，细胞生长周期长，通过慢病毒或者脂质体转染的效率低。将转染成功的SSCs移植回生精小管后，需要经过减数分裂产生精子，再与雌性小鼠交配，产生转基因小鼠后代，整个实验时间周期长且效率低。 3.体外诱导雄性生殖细胞：早在2003年，Toyooka等将小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells， mESCs）与能够分泌骨形态发生蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）的滋养层细胞共培养，将VASA绿色荧光蛋白质（green fluorescent protein，GFP）作为筛选标记表征生殖细胞的产生，能够观测到GFP阳性细胞的产生。研究人员将这群GFP阳性细胞分选出来并移植回不育小鼠睾丸的曲细精管中，能够产生高度分化的精子，但并未对产生的精子进行功能学检测。2004年，Geijsen等报道在mESCs自然分化的时候，会产生一群SSEA1和OCT4阳性的细胞，将这群细胞经过视黄酸（retinoic acid，RA）诱导下能够产生胚胎生殖细胞样（embryonic germ cells， EGCs）克隆。EGCs进一步能够分化产生单倍体类精细胞。通过显微操作将这些分化得到的单倍体类精细胞注入到卵母细胞中，50%的受精卵能够发育到2-细胞阶段，20%能够发育到囊胚阶段，但并没有产生可育的小鼠。以上的这些诱导方式采用的是随机分化的方式，分化的比例低（少于1%），并且得到的生殖细胞数量较少。这些分化效率低的方法并不适合进一步研究生殖细胞发育的机制。2006年，Nayernia等利用Stra8-GFP和Prdm1-dsRed作为报告基因标记ESCs，在RA的诱导下得到单倍体细胞，通过显微注射能够得到存活的小鼠，但是得到的存活小鼠并不健康，且这个工作在之后的研究中并未被成功重复。 随着ESCs培养条件的优化以及对于生殖细胞产生机制的进一步研究，小鼠的生殖细胞体外诱导进一步地发展。Ying等构建了一种不需要血清的mESCs培养条件，在培养基中加入丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3，GSK3）信号通路的两个抑制因子PD0325901和CHIR99021，这种培养基称为2i培养体系。2i培养体系下的mESCs处于更加原始多能性状态。 2011年，Hayashi等将2i培养体系下的ESCs或者iPSCs在激活素A和碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）诱导下形成上胚层样细胞（epiblast-like cells，EpiLCs），进一步在BMP4/8a、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、干细胞因子（stem cell factor，SCF）和表皮细胞生长因子（epidermal growth factor，EGF）等因子的诱导下形成原始生殖细胞样细胞（primordial germ cell-like cells，PGCLCs）。将诱导形成的PGCLCs移植回新生小鼠的睾丸组织中，9~10周后能够产生功能正常的成熟精子。 2016年，在之前研究的基础上，Zhou等将诱导形成的PGCLCs与新生睾丸组织的体细胞共培养，进一步在RA、BMPs和激活素A诱导下形成生殖系干细胞（germline stem cells， GSCs）。形成的GSCs进一步地被诱导最后形成单倍体生殖细胞，将产生的单倍体生殖细胞通过显微操作注入卵母细胞中，最终能够产生健康的后代。 但是以上的诱导方式最后形成的生殖细胞效率低，数量有限，诱导得到的单倍体雄性配子不能在体外稳定地培养，用于体外功能性研究有限。 4.小鼠AG-haESCs的建立：单倍体胚胎分为孤雌单倍体胚胎和孤雄单倍体胚胎两种。孤雌单倍体胚胎只含有来源于卵母细胞的遗传物质，可以将卵母细胞在体外进行孤雌激活或者通过显微操作在受精卵原核时期去除雄原核获得（图1A）。早在1983年，Kaufman等尝试从小鼠孤雌单倍体胚胎中建立孤雌单倍体胚胎干细胞，他们获得了4株胚胎干细胞，但是核型分析显示都是二倍体。这一研究说明在体外从单倍体胚胎建立胚胎干细胞过程中发生了自发二倍体化，说明单倍体的特性不能长期稳定维持。2011年，英国科学家Leeb、Wutz和奥地利科学家Elling等通过流式分选技术富集单倍体细胞的方式，成功地建立了能够长期培养并且维持单倍体特性的孤雌单倍体胚胎干细胞。 孤雄单倍体胚胎只含有来源于精子的遗传物质，可以通过显微操作的方式将精子注入到去核的卵母细胞中，或者在受精卵原核时期去除雌原核的方式获得（图1B）。2012年，两个课题组通过流式富集单倍体细胞，从单倍体胚胎囊胚的内细胞团中成功分离并建立了能够在体外稳定培养的小鼠AG-haESCs。 之后，应用相似的策略，科学家在其他的哺乳动物中也相继成功建立了单倍体胚胎干细胞系。2013年Yang等成功建立了非人灵长类动物食蟹猴的孤雌单倍体胚胎干细胞系；2014年和2016年大鼠的AG-haESCs系和孤雌胚胎单倍体胚胎干细胞系分别成功建立；2016年，Sagi等通过孤雌激活人来源的卵细胞并多次富集的方式成功建立人孤雌单倍体胚胎干细胞；同时，Zhong等通过去除受精卵中雄原核的方式，也成功建立了人孤雌单倍体胚胎干细胞；但灵长类的AG-haESCs系一直未能成功建立。直到2020年，通过优化胚胎构建策略和培养的条件，将21%的高氧培养环境调整至5%的低氧环境，Zhang等成功建立了两株人孤雄单倍体胚胎干细胞系。 单倍体胚胎干细胞具有自我更新和多向分化等干细胞的特点，同时具有单倍体特性。重要的是，小鼠AG-haESCs在注入到卵母细胞中后，能够支持胚胎的全程发育，获得健康可育的小鼠。我们将AG-haESCs注入到卵母细胞（intracytoplasmic AG-haESC injection， ICAHCI）中得到的小鼠称为半克隆小鼠（semi-cloned mice， SC mice）。 体外培养的小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞和AG-haESCs基因组上的甲基化会逐渐丢失，最后形成全基因组上低甲基化的状态。这导致AG-haESCs作为精子替代物注入到卵母细胞中得到的半克隆小鼠的出生率仅在4.5%左右，而存活率只有2%左右。经过分析显示，H19和Gtl2两个雄性印记基因在AG-haESCs系和发育迟缓的半克隆小鼠中出现异常的高表达现象。通过同时敲除AG-haESCs的H19差异甲基化区域（H19-differentially DNA methylated region，H19-DMR）和IG-DMR下调H19和Gtl2的表达之后，半克隆小鼠的出生效率从4.5%上升至20%，且出生后半克隆小鼠能够正常存活。进一步研究表明，H19-DMR在半克隆胚胎发育前12.5 d起重要作用，而IG-DMR主要参与调控胚胎期12.5 d后的发育。由于携带H19-DMR和IG-DMR敲除的AG-haESCs能高效支持半克隆胚胎的发育，我们将其称为类精子干细胞。类精子干细胞兼具胚胎干细胞和精子的特性，可作为载体将基因改造和基因编辑器通过“授精”传递到胚胎中，为高效开展精准复杂遗传改造动物模型的构建提供了新的工具。 二.类精子干细胞的应用 在之前的研究中，主要有三种方式用于构建基因修饰小鼠。①ES细胞打靶：利用同源重组的方式将预先设计好的基因修饰敲入到ES细胞中，再将ES细胞注入进囊胚中，最终得到拥有基因修饰的嵌合体小鼠。该策略能够获得精准复杂编辑的个体。然而，ES细胞打靶周期长，得到的F0代是嵌合体，还需要后续进一步地繁殖鉴定；另外嵌合小鼠是否能将改造的基因传递到子代取决于ES细胞是否能嵌合到生殖腺中，这极大地限制了该策略的效率。②转基因：通过原核显微注射，直接将外源的DNA序列注入到小鼠受精卵的原核中，使外源的DNA序列能够随机地整合到小鼠的基因组中，最终获得随机插入的转基因小鼠。该策略操作简单，然而，原核注射方法产生的是随机转基因的个体，插入的位点随机且拷贝数各不相同，不同的子代产生的表型各不相同，给后面的分析验证带来了不便。③受精卵胞质CRISPR-Cas9直接注射的方法：即通过显微注射，在小鼠的受精卵原核时期或者2-细胞时期将Cas9的mRNA、向导RNA（single-guide RNA，sgRNA）等注入到胚胎中，最后得到基因修饰的小鼠。该策略简单高效，能一步产生基因编辑的个体。然而，由于Cas9的mRNA与sgRNA作用窗口的不确定性，会导致产生嵌合的现象，不仅体细胞中存在基因型的不同，甚至连生殖细胞中也可能产生不同的基因型，增加了后续分析复杂性；另外，该策略无法实现复杂的多基因编辑；再者，该策略只有在获得F0代的小鼠个体后才能够进行基因型的确定，增大了饲养的成本。综合来说，以往的策略无法兼顾精准、复杂和高效，极大限制了哺乳动物功能基因的研究。由于类精子干细胞具备了胚胎干细胞能够用于精准复杂编辑以及可以通过“授精”一步产生个体的特点，结合CRISPR-Cas9基因编辑技术的高效，突破了哺乳动物遗传改造存在的多个瓶颈问题。 1.结合类精子干细胞和CRISPR-Cas9进行遗传筛选：2015年研究人员通过慢病毒将靶向全基因组基因sgRNA文库转染到携带稳定表达Cas9的类精子干细胞中建立细胞系，并通过改善转染条件可以使得尽可能多的类精子干细胞只携带一个sgRNA。进一步将带有Cas9和sgRNA的类精子干细胞注入到卵子中，由于Cas9和sgRNA自注入卵子中后即能编辑sgRNA靶向的基因，因此可以高效地产生等位基因同时突变的小鼠个体，从而实现小鼠个体水平基因功能缺失的遗传筛选。 在最近的一项研究中，Bai等通过结合类精子干细胞和CRISPR-Cas9技术，在小鼠的个体水平实现了骨骼发育相关基因的遗传筛选。为了提高得到基因双链突变小鼠的比例，研究人员进一步优化系统，构建了稳定高效表达Cas9的类精子干细胞系。同时构建了靶向72个候选基因含有216条sgRNA慢病毒文库并转入该细胞中建立了稳定表达Cas9并且带有sgRNA的类精子干细胞，并将其注入到卵子中，最后得到426个半克隆胚胎。通过对出生后半克隆胚胎的骨骼表型进行分析，最后筛选确定出了Zic1、Clec11a、Rln1和Irx5四个参与骨骼发育的基因。 CRISPR-Cas9基因编辑技术发展迅速，2016年David Liu实验室构建了基于CRISPR-Cas9的单碱基编辑系统，该系统能够在不产生DNA双链断裂的基础上实现C>T或者G>A的转变。因此，将单碱基编辑系统与类精子干细胞结合在一起有望在小鼠个体水平上对特定蛋白质的关键氨基酸进行遗传筛选。为了达到这一目的，Li等对影响原始生殖细胞重要基因Dnd1，进行关键氨基酸位点的筛选，最后找到了E59、V60、P76和G82四个影响DND1功能的重要氨基酸位点。该技术为筛选和预测人类疾病的关键致病位点提供了新的策略。 2.利用类精子干细胞构建人类复杂疾病的小鼠模型：基因组的变化和人类疾病息息相关，几个碱基的插入或者缺失、基因拷贝数的变化或者染色体结构的重排等都会导致疾病的发生。随着高通量测序技术的发展，研究人员能够通过对患者的基因组进行测序发现一些基因组上的变化，寻找可能的致病潜在位点。然而，测序得到的数据量较大，得到的候选基因和位点非常多。确定致病基因和位点是疾病诊疗的关键，黄金标准是通过在哺乳动物细胞或者个体水平模拟基因组上的变化并产生相应的表型来确定这些遗传改变是否是造成疾病的原因。类精子干细胞能够在体外稳定培养并且进行基因编辑，可以用于进行基因点突变、碱基的缺失或者插入、大片段的敲除等基因编辑。将基因编辑后的类精子干细胞注入卵母细胞中，能够快速地得到基因编辑的小鼠。另外，类精子干细胞可以进行多轮的编辑，可用于多基因敲除或敲入进而通过注入到卵母细胞中一步获得多基因敲除或敲入小鼠。 最近，Yin等在AG-haESCs中同时敲除4个与人强直性肌营养不良症Ⅰ型（myotonic dystrophy type 1， DM1）疾病相关的Dmpk、Six2、Dmwd和Mbnl1基因，然后再注射到卵子中最终得到4基因同时杂合敲除小鼠模型。表型鉴定显示该小鼠能模拟大多数的DM1患者的表型，证明多基因剂量的下调是导致DM1的关键致病机理。另外，DM1小鼠能够用于DM1疾病治疗的小分子筛选，为研究DM1疾病的发生和治疗提供了新的模型。 女性苗勒管发育不良（Müllerian anomalies， MA）是一个复杂的先天性疾病，该病的患者存在严重的女性生殖道发育障碍。在之前的研究中显示，单基因突变无法模拟该病的表型。最近，Wang等对125例MA患者血液样本进行实时定量PCR检测、全基因组杂交芯片分析显示，9例携带有罕见的基因组拷贝数变异（copy number variants， CNVs）的病例。研究人员利用全外显子测序技术对9例CNVs携带者进行测序，推测“GEN1+WNT9B”“TBX6+GATA3”两种不同的突变组合可能会导致MA的发生。利用类精子干细胞与CRISPR-Cas9技术，构建了“Gen1+Wnt9b”和“Tbx6+Gata3”两种双突变的小鼠。经过表型鉴定，发现“Gen1+Wnt9b”突变的小鼠表现出MA的症状。此研究为MA的发生提供了新的假说。以上的结果都能够很好地说明，类精子干细胞是快速构建复杂人类疾病小鼠模型的有效工具。 3.利用单倍体胚胎干细胞进行印记基因的功能研究：1984年，Solter与Surani分别通过核移植的实验构建了孤雄和孤雌二倍体小鼠胚胎，发现这些胚胎无法正常发育到期。这些实验说明发育过程中父源和母源的染色体基因虽然相同，但是其功能却无法完全对等，由此发现了基因印记这一调控发育的关键表观遗传学机制。 在之前核移植的基础上，将H19-DMR敲除的非生长期卵母细胞（nongrowing oocytes， ng oocytes）与去核的成熟的卵母细胞（full grown oocytes， fg oocytes）融合得到二倍体胚胎。重构的成熟卵母细胞在体外进一步发育成MⅡ期卵母细胞，其遗传物质移植到另一个MⅡ期卵母细胞中形成重构胚胎。将重构胚胎移植回假孕母鼠的体内最终能够得到发育到期的孤雌胚胎。之后以H19-DMR和IG-DMR双敲除的非生长期卵细胞作为供体，孤雌胚胎的出生率显著上升。这些研究表明印记基因在调控小鼠早期胚胎发育的过程中起着关键的作用。研究人员猜想，若在孤雌单倍体胚胎干细胞中敲除H19-DMR和IG-DMR之后能否有效地支撑孤雌胚胎的发育。2016年，Zhong等和Li等在孤雌胚胎干细胞中敲除H19-DMR和IG-DMR，再注入到处于MⅡ期的卵母细胞中，最终能够高效地得到孤雌胚胎。 那么能否在AG-haESCs中通过调控印记基因的表达以支撑孤雄胚胎的发育，得到发育到期的孤雄胚胎呢？最近有研究表明，将Nespas、Grb10、Igf2r、Snrpn、Kcnq1、Peg3和Gnas 7个母源印记基因敲除的AG-haESCs注入到去核的卵母细胞中，再进一步地注入精子最终能够得到二倍体孤雄胚胎。将此二倍体孤雄胚胎培养至囊胚阶段，体外分化形成孤雄二倍体胚胎干细胞，再注入到四倍体囊胚中得到两只孤雄小鼠，然而，两只孤雄小鼠在出生后2 d便死亡，也就是说在这个过程可能还存在其他的重要印记基因发挥调控作用。 4.基于类精子干细胞的基因组标签计划：人类基因组计划完成以后，揭示所有蛋白质功能成为后基因组时代的重要任务。然而，蛋白质的研究依赖于各自抗体，缺乏一个标准化的平台，极大限制了蛋白质功能研究的进展。为了解决这一问题，科学家致力于构建模式生物的全基因组蛋白质标签文库，在模式生物中给全基因组蛋白质基因原位带上同一个标签序列形成标签文库，从而可以通过同一个标签抗体实现蛋白质研究的标准化。2002年，Gavin等构建了1548株蛋白质3'端原位带有串联亲和纯化（tandem-affinity purification， TAP）标签的酵母文库。2003年，Hub等构建了6029株蛋白质C端原位带有GFP标签的酵母文库。研究人员利用蛋白质标签文库酵母细胞系开展了蛋白质的定位和蛋白质相互作用网络的研究。酵母基因组蛋白质标签文库的成功构建是依赖于酵母的单倍体单细胞特性，另外，酵母的同源重组效率非常高。然而，对于小鼠而言，通过传统方法来构建基因组标签文库则困难重重。 2017年5月，基于小鼠类精子干细胞的基因组标签计划（genome tagging project，GTP）被正式提出。类精子干细胞与CRISPR-Cas9结合用于开展GTP项目有以下优势：在注射之前可以直接在细胞水平鉴定基因型，将基因型正确的细胞注入到卵母细胞中，一步获得目的基因修饰小鼠；通过类精子干细胞制备基因修饰小鼠时间短、效率高，从而节约了时间和饲养成本；类精子干细胞可以反复地冻存和复苏，更加方便保存和实验。为了更好地推动GTP的发展，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心于2017年11月成立了GTP研发中心。截至2021年7月30日，GTP研发中心制备了1786个标签细胞系和322个标签小鼠品系。 蛋白质研究依赖于抗体，但是不少的蛋白质缺乏可靠的抗体，使得蛋白质定位和功能研究受阻。GTP的实施能够很好地解决这个问题，可以为研究人员量身定做特定蛋白质的标签小鼠用于蛋白质的在体、实时和动态研究。重要的是，基于GTP平台，通过标准的标签抗体（如HA抗体）就可以同时对一群蛋白质进行研究，确定蛋白质的表达定位以及蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA、蛋白质与RNA之间的相互作用网络。这一研究方案不同于以前对某一个或某几个蛋白质研究策略，可以围绕着某一个生物学的过程，利用相关蛋白质的标签小鼠同时开展多个蛋白质研究，从而更清楚地描绘蛋白质的图谱和相互作用网络，更加彻底地揭示该过程的本质。我们将这一研究方案称为群体蛋白质伙伴组研究。 类精子干细胞介导的半克隆技术在遗传筛选、人类疾病模拟、印记基因功能研究和蛋白质标签打靶等方面已展现出广泛的应用潜力（图 2）。 同时，将其与其他的基因编辑系统，如CRISPR-Cas9激活/抑制系统结合起来，还可以开展基于在体原位激活或者抑制用于基因功能的在体研究。另外，由于类精子干细胞只有1套染色体，便于进行染色体的编辑，构建染色体疾病模型（如21三体综合征或克氏综合征等）小鼠模型。在之前的研究中，有科学家利用CRISPR-Cas9技术将酵母16条染色体融合为一条，且发现染色体融合对于酵母并没有产生显著的影响。那么小鼠等高等真核生物的染色体数量和结构变化会产生什么影响呢？在类精子干细胞中改造染色体的结构和数量，如实现染色体融合等，再将染色体改造过的类精子干细胞注入到卵母细胞中，可以研究染色体数量和结构变化对哺乳动物胚胎发育的影响。 单倍体胚胎干细胞是用于遗传筛选的重要工具，但在单倍体胚胎干细胞中仍然存在一些问题有待解决，如单倍体在体外培养的过程如何避免发生自发二倍体化。虽然有研究表明通过敲除p53和p73，能够有效地稳定单倍体胚胎干细胞的单倍体状态，但是单倍体发生二倍体化的具体机制还有待进一步地阐释。因此，未来可以通过基因的激活或者敲除的方式开展单倍体胚胎干细胞单倍体维持的遗传筛选研究，发现一些参与该过程的重要基因，对于我们理解单倍体维持的机制具有重要的意义。同时，类精子干细胞携带有H19-DMR和IG-DMR的敲除突变，如果能够通过优化培养条件稳定维持印记基因的印记状态，就可以去除H19-DMR和IG-DMR敲除对胚胎发育可能产生的影响。另外，类精子干细胞与精子相比，还存在大量表观遗传的差异，未来的研究可以确定决定发育的重要表观遗传位点并在类精子干细胞中进行模拟，从而进一步提高半克隆胚胎的发育效率。这些问题的解决不仅能够加深对诸如细胞倍性维持、发育的表观遗传调控等基础科学问题的了解，还有望进一步促进单倍体胚胎干细胞在生命科学研究中的应用。 学科网（北京）股份有限公司 $$