3.2.2 基因工程的基本操作程序（第二课时）-2023-2024学年高二生物同步教学讲解课件(人教版2019选择性必修3）

3.2.2 基因工程的基本操作程序 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 4种脱氧核苷酸（DNTP） 引物 待扩增的DNA片段（模板） 5’ 5’ 变性 复性 延伸 温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。 PCR回顾 2 能不能直接将目的基因导入受体细胞，为什么？如果不能，如何避免该结果的发生呢？ 不能。游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，且游离的DNA片段不能稳定遗传。 构建基因表达载体（核心工作） 思考 1.构建基因表达载体的目的： 思考：各个元件有什么作用？ （1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代； （2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。 二、基因表达载体的构建——核心步骤 2.基因表达载体的组成 02 目的基因：能控制表达所需要的特殊性状 必须插到启动子和终止子之间 复制原点： DNA复制的起始位点 终止子： 本质：有特殊序列结构的DNA片段 位置：基因的下游 功能：终止转录 四环素抗性基因、荧光蛋白基因等 二、基因表达载体的构建——核心步骤 启动子： 本质：有特殊序列结构的DNA片段 位置：基因的上游 功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 标记基因：作用为鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来 注意：目的基因必须插入到 与 之间。 启动子 终止子 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 位置 作用 DNA mRNA 转录的起点和终点 翻译的起点和 终点 二、基因表达载体的构建——核心步骤 载体≠表达载体 二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。 表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。 两个黏性末端 （或平末端） 质粒（载体） DNA分子（含目的基因） 获得目的基因，带有 两个切口两个黏性末端 （或平末端） DNA 连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 同种 限制酶 （或同尾酶） 二、基因表达载体的构建——核心步骤 3.构建过程： 复述过程 （1）用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出___________。 （2）用______________切断目的基因，使其产生_________________。 （3）将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入 适量_____________，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）。 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 的黏性末端 切口 DNA连接酶 相同 1.只用一种限制酶切割的时候会出现什么现象？ 反向连接 单酶切缺点: 质粒重新环化 目的基因自身环化 质粒与目的基因反向连接 思考讨论 双酶切 2.如何防止目的基因和载体的自身环化以及目的基因的反向连接？ 使用两种限制酶的优点： ①防止目的基因和载体的自身环化 ②还可以防止目的基因与载体的反向连接 思考讨论 用什么限制酶切割最合适？ 将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样？ 这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体细胞。 由于不同转基因产品所需要的目的基因不同，受体细胞又有植物、动物、微生物之分，因此基因表达载体的构建方法不是千篇一律的,将目的基因导入受体细胞的方法也不完全相同。 将目的基因与载体结合，构建好基因表达载体后，下面该进行什么操作？ 基因工程第三步：将目的基因导入受体细胞 思 考 常用方法 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 农杆菌转化法 花粉管通道法 ——显微注射法 ——Ca2+处理法 我国科学家独创 三、将目的基因导入受体细胞 三、将目的基因导入受体细胞 1.目的基因导入植物细胞 花粉 外源DNA 花粉管 子房 胚珠 子房 花粉 柱头 花粉管 精子 卵细胞 胚囊 ①用_____________将_________________________直接注入______中； 微量注射器 含目的基因的DNA溶液 ② 在植物受粉后的一定时间内，剪去______，将____________滴加在___________上，使目的基因借助_____________进入_______； 柱头 DNA溶液 花柱切面 花粉管通道 胚囊 受体细胞： 受精卵 简便经济，但要求花朵较大 子房 14 转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和 表达的过程。 实质是基因重组。 （2）农杆菌转化法 三、将目的基因导入受体细胞 1.目的基因导入植物细胞 农杆菌特点 a. 能在自然条件下侵染_____________和___________，而对大多数_____________没有侵染能力； 双子叶植物 裸子植物 单子叶植物 b. 农杆菌细胞内含有________，当它侵染植物细胞后，能将________上的________（_______________）转移到被侵染的细胞，并且将其_______________________________； Ti质粒 Ti质粒 T-DNA 可转移的DNA 整合到该细胞的染色体DNA上 15 16 目的基因 Ti质粒 表 达 载 体 农杆菌 植物细胞 植物细胞 染色体DNA 新性状植株 构建 转入 导入 插入 表达 三、将目的基因导入受体细胞 1.目的基因导入植物细胞 过程： （2）农杆菌转化法 1.农杆菌转化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA与目的基因是什么关系？ T-DNA不是目的基因，但它将来会被整合到宿主细胞染色体的DNA上，只要将目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以随T-DNA进入宿主细胞并整合到宿主细胞的染色体上。 2.农杆菌转化法中，目的基因只能进入植物的一个体细胞中，但基因工程最终要的是一个转基因植株，如何实现这一目标？ 得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养 三、将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法 两次拼接、两次导入 ①两次拼接 第一次拼接：目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上； 第二次拼接(非人工操作)：被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。 农杆菌转化法 两次拼接、两次导入 ②两次导入 第一次导入：将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌； 第二次导入(非人工操作)：含目的基因的T-DNA导入受体细胞。 03 （1）常用方法： （2）受体细胞: 显微注射法 受精卵 三、将目的基因导入受体细胞 2.目的基因导入动物细胞 受精卵 注射器 固定吸管 ①体积大，易操作。②易表现出全能性。 原核细胞（常选择大肠杆菌） （1）受体细胞： （2）常用方法： Ca2+处理 增加细胞壁的通透性，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）。 感受态细胞 吸收 三、将目的基因导入受体细胞 3.目的基因导入微生物细胞 繁殖快 单细胞 遗传物质少 易培养 增加细胞壁的透性，与细胞膜无关 21 小结：将目的基因导入受体细胞的方法 种类 项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法       受体细胞       转化过程 目的基因插入Ti质粒的T­DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达 构建目的基因表达载体→取受精卵→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→感受态→导入基因表达载体 农杆菌转化法 显微注射法 Ca2＋处理法 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？ 即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？ 思考 不一定！ 检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。 分子水平 检测目的基因（PCR等技术检测） 检测mRNA（PCR等技术检测） 检测表达的蛋白质 （抗原—抗体杂交） 四、目的基因的检测与鉴定 个体水平 24 ①检测目的基因是否导入 如：检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因 ——通过PCR等技术检测 提取棉花细胞DNA 用与Bt基因相关的 引物进行PCR扩增 对扩增产物进行检测 （一）分子水平的检测 四、目的基因的检测与鉴定 M：marker；1-阳性质粒； 2：原始品系；3-9转Bt品系； 转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果 提取棉花细胞mRNA 逆转录 产生DNA 对扩增产物进行检测 用与Bt基因相关的 引物进行PCR扩增 ②检测目的基因是否转录 ——通过PCR等技术检测 （一）分子水平的检测 四、目的基因的检测与鉴定 苏云金芽孢杆菌 提取 Bt毒蛋白 注射小鼠体内 抗体 标记抗体 提取蛋白 抗原 抗体 杂交 脱分化 （一）分子水平的检测 从棉花中 提取蛋白质 用相应抗体进行 抗原-抗体杂交检测 ③检测目的基因是否翻译 ——通过抗原-抗体杂交检测 四、目的基因的检测与鉴定 从转基因生物提取出来的蛋白质和相应的抗体进行杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已经翻译。 检测目的基因是否表现出相应的性状 检测抗虫棉是否具有抗虫性状 采摘抗虫棉叶片 饲喂 棉铃虫 观察棉铃虫存活情况 （二）个体水平的检测 四、目的基因的检测与鉴定 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）接种实验 未染病 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 个体水平检测：抗性以及抗性程度 筛选和获取目的基因 1.利用PCR获取和扩增目的基因 2.人工合成目的基因 3.通过构建基因文库获取目的基因 第一步：目的基因的筛选与获取 构建基因表达载体 1.用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段 2.用DNA连接酶连接 第二步：基因表达载体的构建 将含有目的基因的表达载体导入受体细胞 1.导入植物细胞：花粉管通道法；农杆菌转化法 2.导入动物细胞：显微注射法 3.导入原核细胞：用Ca2+处理受体细胞 第三步：将目的基因导入受体细胞 检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性 1.分子水平检测 ①检测目的基因是否导入（PCR等技术检测） ②检测目的基因是否转录（PCR等技术检测） ③检测目的基因是否翻译（抗原-抗体检测） 2.个体水平检测 第四步：目的基因的检测与鉴定 小结：基因工程 一、概念检测 练习与应用 1. 研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp加整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。 （1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因 （ ） （2） 构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。 （ ） （3） 只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。 （ ） × × √ 35 二、拓展应用 1. 研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。 外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。 36 当堂巩固 1、（2022春·陕西渭南·高二统考期末）下列有关基因表达载体的叙述，错误的是（    ） A．具有复制原点，使目的基因能在受体细胞内扩增 B．具有启动子，作为翻译多肽链的起始信号 C．具有标记基因，有利于目的基因的检测和筛选 D．具有目的基因，以获得特定的基因表达产物 B 当堂巩固 2、（2022春·浙江嘉兴·高二校考期中）下列技术依据碱基互补配对原理的是（    ）。 ①检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因     ②检测目的基因是否转录出了mRNA     ③检测目的基因是否翻译成蛋白质     ④通过观察害虫吃棉叶是否死亡判断棉花是否被赋予了抗虫特性 A．①②③④ B．①② C．①②④ D．①②③ B 当堂巩固 3、（2022春·浙江宁波·高二效实中学校考期中）下图为基因工程中基因表达载体的模式图，相关叙述错误的是（    ） A．基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建 B．图中启动子位于目的基因的首端，是核糖体识别和结合的部位 C．复制原点是基因表达载体在受体细胞中独立复制和稳定存在所必需的 D．抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因 B 琼脂糖凝胶电泳 思考：如何对PCR扩增的产物进行鉴定？ 探究•实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 一.实验原理 （1）利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理 ①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环； ②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理； 变性 90˚C 延伸 72˚C 复性 50˚C （2）DNA片段电泳鉴定的原理 ①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳 ； ②PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定； ③在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小 和构象等有关（迁移速率与之呈负相关） ④凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 探究•实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.试剂： （1）无菌水、琼脂糖； （2）电泳缓冲液（TAE或TBE）； （3）凝胶载样缓冲液（内含指示剂——溴酚蓝）； （4）核酸染料（常用核酸染料为EB即溴化乙锭）。 （5）PCR反应体系的配方 材料 用量 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL 二.材料用具 3.方法步骤 探究•实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 （1）DNA片段的扩增 移液 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分 离心 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率） 反应 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 可根据目的片段长度适当调整延伸时间 预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min / / 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min 3.方法步骤 （2）DNA片段的电泳鉴定 ①配制琼脂糖溶液 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀 ②制备凝胶 A.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 C.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 B.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 探究•实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 ③加样 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物 ④电泳 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 ⑤观察记录 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 3.方法步骤 探究•实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 注意: ①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 ②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 ③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 ④在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 ⑤PCR扩增不能随意加大试剂用量。 探究•实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 4.结果分析与评价 (1)你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ (2)你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。 如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。 探究•实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 【三点提醒】 ①在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 ②引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行 复制时，也需要引物，一般为RNA片段；PCR引物一般为DNA片段。 ③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。 因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。 探究•实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 dATP与ATP在结构上有什么区别？dATP为什么能用作DNA复制的底物？ 如图所示，ATP结构中的五碳糖为核糖，而dATP结构中的五碳糖为脱氧核糖。 ATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤核糖核苷酸，所以ATP是转录的底物；同理，dATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，所以dATP可以用作DNA复制的底物。 用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是(　　) A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间 B.3号样品为不含目的基因的载体DNA C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰 B 53 Lavf58.51.100 EVCapture4.2.2软件录制 Lavf57.25.100 本视频由湖南一唯信息科技开发的EV录屏软件录制，www.ieway.cn $$