第2章 细胞工程（知识清单）-2023-2024学年高二生物下学期期末复习大礼包（讲+背+练）

第2章 细胞工程 知识清单 第一节 细胞工程 一、植物细胞工程的基本技术 1.细胞工程概念： 细胞工程是指应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科的原理和方法，通过细胞器、细胞或组织水平上的操作，有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品的一门综合性生物工程。 ①原理方法：细胞生物学、分子生物学和发育生物学； ②操作水平：细胞器、细胞或组织水平； ③目的：得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品； ④分类：植物细胞工程、动物细胞工程。 （一）植物细胞的全能性 1．概念：细胞经分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能。 2.在生物生长发育过程中，并不是所有细胞都表现出全能性，比如：芽原基的细胞发育为芽，叶原基的细胞发育为叶。这是因为在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性地表达。 3.是否表现出全能性的判断标准：细胞经分裂和分化后是否产生完整生物体。 4.细胞具有全能性的原因（物质基础）：一般来说，生物体的细胞中都含有该物种的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所需的全部遗传信息。 5.生物体生长发育过程中细胞不表现全能性的原因（不离体的细胞无法表现出全能性的原因）：在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性地表达（从而形成生物体的不同组织和器官）。 6.是不是所有的活细胞都具有全能性？不是，例如哺乳动物成熟的红细胞、植物成熟的筛管细胞。 7.细胞具有的全能性一定能表现出来吗？不是，例如动物的体细胞。 8.比较一般情况下下列细胞全能性的大小 (1)受精卵＞生殖细胞＞体细胞 (2)分化程度低的细胞＞分化程度高的细胞、 (3)分裂能力强的细胞＞分裂能力弱的细胞 (4)植物细胞＞动物细胞 (5)幼嫩的细胞＞衰老的细胞 9.以下例子哪些能够表现出了细胞的全能性：（1）、（3）、（4）、（6）、（7） (1)利用菊花茎段培养获得试管苗。 (2)芽原基的细胞发育为芽，叶原基的细胞发育为叶。(3)受精卵发育成个体。 (4)蜜蜂的孤雌生殖中，卵细胞直接发育成雄蜂。 (5)造血干细胞可分化形成多种血细胞。 (6)通过花药离体培养，获得单倍体幼苗。 (7)胚胎干细胞可分化发育成为各种组织器官的细胞。 (8)种子发育成完整植株。 （二）植物组织培养技术 1．植物组织培养概念：将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。 2.植物组织培养的原理：植物细胞的全能性。植物组织培养的生殖方式：无性生殖。植物组织培养的分裂方式：有丝分裂。 4.植物组织培养流程： 植物组织培养流程为“①②③―→试管苗完整植株”，其中数字序号处填写内容依次为：①外植体、②愈伤组织③根、芽等。①具体指的是离体培养的植物器官、组织或细胞；脱分化是指在一定的激素和营养等条件的诱导下，已经分化的细胞转变成未分化细胞的过程；经脱分化形成的是不定形的薄壁组织团块，这称为愈伤组织。再分化是指愈伤组织重新分化成芽、根等器官的过程；植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素,它们的浓度、用量的比例等都会影响植物细胞的发育方向。 5.菊花植物组织培养 （1）选材：经常选择根尖（分生区）、茎的韧皮部（形成层）等。原因：无毒或少毒，分裂能力强、分化程度低，容易诱导形成愈伤组织。 （2）操作流程： ①外植体的消毒：将流水冲洗后的外植体用酒精消毒30 s，用无菌水清洗2～3次后，再用次氯酸钠溶液处理30 min，用无菌水清洗2～3次。若想缩短次氯酸钠溶液处理时间应适当提高次氯酸钠溶液的浓度。 ②外植体的分割：用无菌滤纸吸去表面的水分，用解剖刀将外植体切成0.5～1 cm长的小段。大小应适宜。 ③接种：在酒精灯火焰旁，并且实验中使用的培养基和所有的器械及每次使用后的器械都要灭菌，将外植体的1/3～1/2插入诱导愈伤组织的培养基中。用封口膜或瓶盖封盖瓶口，并在培养瓶上做好标记。接种时注意外植体的方向，不要倒插。 ④培养：将接种了外植体的锥形瓶或植物组织培养瓶置于18～22 ℃的培养箱中培养。定期观察和记录愈伤组织的生长情况。诱导愈伤组织期间一般不需要光照，在后续的培养过程中，每日需要给予适当时间和强度的光照。 ⑤转移培养（再分化过程）：培养15-20d后，将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上。长出芽后，再将其转接到诱导生根的培养基上，进一步诱导形成试管苗。 ⑥移栽：试管苗不可以直接移栽入土，需先打开封口膜或瓶盖，让试管苗在培养箱内生长几日，将试管苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩上，壮苗后再移栽入土。 （3）若培养物取自植物的幼茎、叶片等含有叶绿体的部位，愈伤组织中是否会含有叶绿体？为什么？ 愈伤组织中不含有叶绿体；培养物经过诱导后，失去其特有的结构和功能而转变成未分化细胞，因此，愈伤组织中不含有叶绿体。 （4）植物组织培养中细胞表现出全能性的条件：①离体（最关键）。②严格的无菌条件。③适宜的培养条件。④适宜浓度和比例的激素。⑤一定的营养条件。 （5）为什么一定要离体才能表现出全能性？若细胞不离体，细胞中的基因会选择性地表达，从而形成生物体的不同组织和器官，不能表现出全能性。 （6）如何控制严格的无菌条件？ ①用体积分数为70%的酒精对手、超净工作台、外植体进行消毒,对外植体处理还需要质量分数为5%左右的次氯酸钠溶液,清洗外植体需要使用无菌水。 ②)对培养基和器械进行灭菌； ③接种操作必须在酒精灯火焰旁进行。 （7）适宜的培养条件包括那些？ ①温度（例如菊花植物组织培养应为18-22℃）。②光照（例如脱分化需避光，再分化需照光）。 （8）一定的营养条件如何保证？配制合适的培养基，包括有机营养成分、无机营养成分、特定浓度和比例的激素。 （9）培养基组成 ①无机营养成分（水和无机盐）, ②有机营养成分（蔗糖、氨基酸、维生素）, ③特定浓度和比例的激素（主要是生长素和细胞分裂素）。 注意：蔗糖的作用：提供能量，调节渗透压。培养基灭菌方法为：湿热灭菌法（高压蒸汽灭菌）。 （10）为什么整个过程要保证无菌操作？避免杂菌在培养基上迅速生长消耗营养，同时防止有些杂菌危害培养物的生长。 （11）整个过程中使用的培养基中是一成不变的吗？不是。 分别为诱导愈伤组织的培养基→诱导生芽的培养基→诱导生根的培养基。 （12）以上培养基中，生长素/细胞分裂素的比值大小是如何变化的？ 比值适中→比值低→比值高。 （13）接种后，外植体被污染的可能原因：①培养基、接种工具灭菌不彻底。②外植体消毒不彻底。 ③操作过程不符合无菌操作要求等。 （14）若想探究生长素与细胞分裂素的使用比例对植物组织培养的影响，则应如何设计对照实验？ 空白对照：不加任何激素。 实验组1：生长素用量与细胞分裂素用量的比值为1； 实验组2：生长素用量与细胞分裂素用量的比值大于1； 实验组3：生长素用量与细胞分裂素用量的比值小于1。 （三）植物体细胞杂交技术 1.用传统的有性杂交方法都能得到杂种后代吗？为什么？不是，因为两种生物之间存在着生殖隔离。 2．植物体细胞杂交的概念：将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。 3.下图为植物体细胞杂交技术流程图。字母a～f表示相关过程，其中a为去除细胞壁的过程，用到的酶是纤维素酶和果胶酶。b表示人工诱导原生质体融合的过程，诱导的方法基本可以分为两大类—物理法和化学法。物理法包括离心法、电融合法等;化学法包括聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+—高pH融合法等。过程c是原生质体融合后再生出新的细胞壁的过程。过程d表示脱分化，e表示再分化，过程f用到的技术是植物组织培养技术，其原理是细胞的全能性。甲～戊表示相关细胞或结构，甲、乙不是（是、不是）结构完整的植物细胞，丙表示正融合的原生质体，丁表示杂种细胞，戊表示愈伤组织。 4.植物体细胞杂交的主要步骤：植物细胞融合和植物组织培养。 （1）在进行体细胞杂交之前，去壁原因：细胞壁阻碍着细胞间的杂交（阻碍了原生质体间的融合）。 （2）细胞融合完成的标志：再生出新的细胞壁。 植物体细胞杂交完成的标志：培育出杂种植株。 （3）再生出细胞壁的相关的细胞器：高尔基体和线粒体。 （4）验证再生出新壁的实验：质壁分离和质壁分离复原实验。 5.纤维素酶和果胶酶的酶溶液中一般加入一定浓度的无机盐离子和甘露醇，试分析原因？ 使溶液具有一定的渗透压，防止原生质体吸水过多而涨破，保持原生质体正常。 5.①植物体细胞杂交的原理：细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性。②植物体细胞杂交的生殖方式：无性生殖。③植物体细胞杂交的分裂方式：有丝分裂。④植物体细胞杂交的涉及的可遗传变异类型：染色体变异。 6.获得的所有细胞一定是需要的杂交细胞吗？不一定；诱导融合后的产物有三类：未融合的细胞、两两融合的细胞、多细胞融合体。 7.植物体细胞杂交的意义：打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种等方面展示出独特的优势。 8.杂种植株包含两个物种的全部遗传物质，各种基因都包含在内，却未按照人们的要求表现出亲本所有的性状，例如“番茄-马铃薯”并没有地上结番茄，地下长马铃薯，这是为什么？ 生物体内基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，杂种植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达相互干扰，它们不能像在原植株细胞内实现有序表达，因此不能按照人们的要求表现出亲本所有的性状。 2、 植物细胞工程的应用 1.利用植物细胞工程，可以快速繁殖优良品种、培育作用新品种、进行作用脱毒和细胞产物的工厂化生产等。（P65“本章小结”） （一）植物繁殖的新途径 1.植物繁殖的新途径包括快速繁殖（也叫微型繁殖）和作物脱毒。 2.快速繁殖 (1)快速繁殖概念：用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术。 (2)优点：可以高效、快速地实现种苗的大量繁殖；无性繁殖可以保持优良品种的遗传特性；可实现工厂化生产。 (3)实例：一些优良的观赏植物、经济林木、无性繁殖作物和濒危植物等都实现了利用快速繁殖技术来提供苗木。甘蔗、桉树和铁皮石斛等试管苗的生产，已形成一定规模。 注意：扦插、压条、嫁接等不属于微型繁殖技术。 3．作物脱毒 (1)概念：植物顶端分生区附近（如茎尖）的病毒极少，甚至无病毒。因此，切取一定大小的茎尖进行组织培养，再生的植株就有可能不带病毒，从而获得脱毒苗。 (2)优点：提高作物的产量和品质。 (3)实例：采用茎尖组织培养技术脱去病毒，已在马铃薯、草莓、大蒜、甘蔗、菠萝和香蕉等许多作物上获得成功。 注意： ①适用范围：无性繁殖的作物(马铃薯、草莓、香蕉）。 ②进行作物脱毒的原因：用无性繁殖的方式进行繁殖的作物，它们感染的病毒很容易传给后代，病毒在作物体内逐年积累，就会导致作物产量降低、品质变差。 ③外植体选材部位：植物顶端分生区附近部位，如茎尖。 ④选分生区的原因：植物顶端分生区附近病毒极少，甚至无病毒。 ⑤作物脱毒具体操作过程：切取一定大小的茎尖进行组织培养，再生的植株就有可能不带病毒，从而获得脱毒苗。 ⑥脱毒苗是否不会再感染病毒？不是，脱毒苗≠抗毒苗。“脱毒”与“抗毒”不同，前者指的是本身病毒少，甚至无病毒，受病毒感染的机会少，而后者指的是能抵抗病毒的感染。 （二）作物新品种的培育 1.作物新品种的培育包括单倍体育种和突变体的利用。 2.单倍体育种 （1）概念：单倍体育种是指先通过花药（或花粉）培养获得单倍体植株，然后经过诱导染色体加倍，培育出遗传性状相对稳定的纯合二倍体植株。 (2)过程：请以二倍体植物为例，用“文字、→”写出单倍体育种流程图：花药(或花粉)单倍体植株纯合二倍体植株优良品种。这种育种方法的原理是细胞的全能性和染色体变异， (2)优点 ①后代是纯合子，能稳定遗传。 ②极大地缩短了育种的年限，节约了大量的人力和物力。 ③大多数单倍体植株可作为进行体细胞诱变育种和研究遗传突变的理想材料。 (3)实例：世界上第一个单倍体作物新品种——单育1号烟草；单倍体育种与常规育种相结合的新品种：水稻、玉米、油菜、甘蓝和甜椒等。 (4)为什么大多数单倍体植株可作为进行体细胞诱变育种和研究遗传突变的理想材料？大多数单倍体植株的细胞中只含一套染色体，染色体加倍后得到的植株的隐性性状容易显现。 2．突变体的利用 （1）过程： （2）诱变处理对象：一般为愈伤组织。 （3植物的组织培养过程中易产生突变，其原因是培养细胞一直处于不断的分生状态，因此容易受到培养条件和诱变因素（如射线、化学物质等）的影响而产生突变。 （4）原理：基因突变和植物细胞的全能性。 （5）利用：筛选出有用的突变体，培育新品种。如培育抗病、抗盐、高产以及蛋白质含量高的突变体。 （6）实例：抗花叶病毒的甘蔗、抗盐碱的烟草等。 （三）细胞产物的工厂化生产 1.代谢产物的分类 a.初生代谢产物：初生代谢是生物生长和生存所必需的代谢活动因此在整个生命过程中它一直进行着；初生代谢产物：糖类、脂质、蛋白质、核酸等 b.次生代谢产物：植物代谢会产生一些一般认为不是生物生长所必需的，一般在特定组织或器官中，并在一定的环境和时间条件下才进行。 产物：一类小分子有机化合物（如酚类、萜类、含氮化合物等)2.细胞产物的工厂化生产的目标产物：次生代谢产物。 3.次生代谢物作用：在植物抗病、抗虫等方面发挥作用，也是很多药物、香料和色素等的重要来源。 4.生产技术手段：植物组织培养技术（在离体条件下对单个植物细胞或细胞团进行培养使其增殖的技术）。 5.过程： 6.细胞产物工厂化生产主要利用的是哪种结构？愈伤组织。 7.该过程中是否需要培养得到完整植株？一般不需要。 8.优点：不占用耕地，几乎不受季节、天气等的限制，对于社会、经济、环境保护具有重要意义；生产速度快。 9．实例：利用紫草细胞的组织培养生产的紫草宁具有抗菌、消炎和抗肿瘤等活性。利用红豆杉细胞的组织培养生产的紫杉醇具有高抗癌活性。 第2节　 动物细胞工程 动物细胞工程包括：动物细胞培养、动物细胞融合、动物细胞核移植。其中动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 一、动物细胞培养 1.动物细胞培养概念：指从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。 2.动物细胞培养的原理：细胞增殖（有丝分裂）。 3.动物细胞培养的地位：动物细胞工程的基础。 4.动物细胞培养的关键操作：原代培养和传代培养。 （一）动物细胞培养的条件 （1）细胞在体外培养时，培养基中应含有细胞所需要的各种营养物质。将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。由于人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚，因此在使用合成培养基时，通常需要加入血清等一些天然成分。 （2）培养动物细胞一般使用液体培养基，也称为培养液。 2.无菌、无毒的环境：在体外培养细胞时，必须保证环境是无菌、无毒的。 3.温度、pH和渗透压：维持细胞生存必须有适宜的温度。哺乳动物细胞培养的温度多以36.5℃±0.5℃为宜。多数动物细胞生存的适宜pH为7.2～7.4。此外，渗透压也是动物细胞培养过程中需要考虑的一个重要环境参数。 4.气体环境：动物细胞培养所需气体主要有和CO2和O2：O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。在进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶,并将它们置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。 物细胞培养的培养基的物理性质：培养动物细胞一般使用液体培养基，也称为培养液。 5.保证无菌、无毒环境的具体措施 （1）对培养液和所有培养用具进行灭菌处理。 （2）在无菌环境下进行操作。 （3）还需要定期更换培养液。 6.培养液的灭菌方法：湿热灭菌法（高压蒸汽灭菌）。 培养用具的灭菌方法：湿热灭菌法（+烘干）或干热灭菌法。 7.怎样保证无菌操作？ 对操作空间、操作者衣着和手进行清洁和消毒，保证所有操作均在在超净工作台并在酒精灯火焰旁进行。 8.为什么培养液需要定期更换？ 以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。 9.如何防止培养过程中的微生物污染？ 在细胞培养液中添加一定量的抗生素。 10.维持适宜渗透压的目的维持细胞正常的形态和功能。 （二）动物细胞培养的过程 取动物组织→制成细胞悬液→转入培养液原代培养→分瓶→传代培养 阅读教材P44相关文字及P45“图2-12”，写出下面动物细胞培养示意图中①～⑤处的内容：①用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等，②原代培养，③二氧化碳培养箱，④胰蛋白酶，⑤传代培养。 1.动物细胞培养取材：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官。取材原因：细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养。 2.制成细胞悬液的步骤（1）将组织分散成单个细胞。（2）用培养液将细胞制成细胞悬液。 3.将组织分散成单个细胞的原因 （1）从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖； （2）能使细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换。 4.将组织分散成单个细胞的方法(1)机械法;(2)用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间。 5.（1）用胰蛋白酶分散细胞，可以说明什么问题？动物细胞间的物质主要是蛋白质。 （2）可以用胃蛋白酶分散细胞吗？不可以。为什么？胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性，多数动物细胞培养的适宜pH为7.2-7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，所以用胃蛋白酶不行。 6.酶解法较温和，一定不会对动物细胞造成损伤吗？不是，使用胰蛋白酶时，要控制好作用时间，因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质，长时间作用还会分解细胞膜蛋白等，对细胞造成损伤。 7.体外培养的动物细胞的两大类： （1）能够悬浮在培养液中生长增殖。 （2）大多数需要贴附于某些基质表面才能生长增殖（细胞贴壁）。 8.两类细胞的生长特点 （1）悬浮生长类：会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。 （2）贴壁生长类：除会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻外，还会发生接触抑制。 9.“细胞增殖到互相接触的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续繁殖，出现接触抑制的现象”试结合上述解释，举例说明哪种细胞最可能无接触抑制现象，并阐述原因：癌细胞，癌细胞的细胞膜上糖蛋白等物质减少。 10．原代培养 （1）原代培养：通常将分瓶之前的细胞培养，即指动物组织经处理后的初次培养。 （2）原代培养的具体做法：将初次制备好的细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中培养。 11．传代培养 （1）传代培养：将分瓶后的细胞培养。 （2）分瓶传代培养的具体做法: ①收集细胞 a.悬浮生长类：直接用离心法收集。 b.贴壁生长类：重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。 ②将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。 12.为什么动物细胞培养中需分瓶进行传代培养？ 细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻，贴壁细胞还会发生接触抑制现象。 13.离心的作用：在沉淀中得到细胞，同时去掉上清液中的胰蛋白酶。 14.动物细胞培养技术有没有体现动物细胞的全能性？ 未体现，动物细胞培养只是细胞增殖的过程。 15.正常细胞不能一直传代培养下去；细胞的传代培养一般传至10代后就不易传下去，这时细胞能保持细胞正常的二倍体核型；传至10-50代左右时，增殖会逐渐缓慢，以至于完全停止，这时部分细胞的细胞核型可能会发生变化，这一阶段的细胞称为细胞株; 继续传代培养时，少部分细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正在朝着等同于癌细胞的方向发展，这一阶段的细胞称为细胞系，细胞系的遗传物质一定改变了。 思考： 1.下图为动物细胞培养示意图，①可表示胰蛋白酶或胶原蛋白酶。②指原代培养，即：将动物组织经处理后的初次培养。②过程中培养的动物细胞可以分为两大类：一类细胞能够悬浮在培养液中生长增殖，即图中的悬浮生长；另一类则需要贴附于某些基质表面才能生长增殖，即图中的贴壁生长，大多数细胞属于这种类型，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上，这种现象称为细胞贴壁。悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。贴壁细胞在生长增殖时，除受上述因素的影响外，还会发生接触抑制现象,即当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。这时就需要对细胞进行分瓶培养，让细胞继续增殖，即图中的③传代培养。其具体操作为：对悬浮培养的细胞直接用离心法收集；贴壁细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。之后，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。（P44“教材”、P45“图2-12”） 2.若对植物组织培养与动物细胞培养进行比较，从原理看，植物组织培养原理为植物细胞的全能性，动物细胞培养原理为细胞增殖；从培养基看，植物组织培养所用为固体培养基，动物细胞培养所用为液体培养基；若用文字、“→”表示培养过程，植物组织培养过程可表示为：外植体愈伤组织芽、根或胚状体植物体，动物细胞培养可表示为：动物的组织细胞悬液→原代培养→细胞悬液→传代培养；从结果看，植物组织培养最终形成新植株，动物细胞培养最终形成新细胞。但两者也存在相同的方面：①两技术手段培养过程中都进行细胞的有丝分裂，都不涉及减数分裂；②均需要无菌操作、无菌培养，需要适宜的温度、pH等条件。 （三）干细胞的培养及其应用 1．干细胞功能：在一定条件下，可以分化成其他类型的细胞。 2．干细胞的分布：早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。 3．干细胞的种类：包括胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞等。 4.胚胎干细胞（简称ES细胞） （1）分布：存在于早期胚胎中。 （2）特点：具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。 5.成体干细胞 （1）分布：存在于成体组织或器官内中。 （2）常见类别：包括骨髓中的造血干细胞、神经系统中的神经干细胞、睾丸中的精原干细胞等； （3）特点：一般认为，成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。 （4）发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例：造血干细胞，主要存在于成体的骨髓、外周血和脐带血中。 6.诱导多能干细胞概念：通过体外诱导成纤维细胞，获得类似胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞，简称iPS细胞。 7.诱导多能干细胞优点： （1）诱导过程无需破坏胚胎。 （2）iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。 8.干细胞的应用：有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。9.干细胞应用实例 （1）造血干细胞可以治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病。 （2）神经干细胞可以治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）。 （3）诱导多能干细胞（iPS细胞）可治疗小鼠的镰状细胞贫血症，在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展。 9.干细胞可以治疗某些顽症的原理是什么？ 干细胞可以被诱导分化形成新的组织细胞，经移植可使坏死或退化部位得以修复并恢复正常功能。 10.胚胎干细胞的局限性：必须从胚胎中获取 ，涉及伦理问题。 11.普遍认为iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞。 12.iPS细胞用于治疗人类疾病过程 取成纤维细胞 转入相关因子 细胞转化为iPS细胞 诱导iPS细胞定向分化为多种组织细胞 移植回病人体内。 13.制备iPS细胞的其他方法 （1）借助载体将特定基因导入细胞中诱导形成iPS细胞。 （2）直接将特定蛋白导入受体细胞中诱导形成iPS细胞。 （3）用小分子化合物来诱导形成iPS细胞诱导形成iPS细胞。 14.iPS细胞的来源：成纤维细胞以及已分化的T细胞、B细胞。 15.如果想将iPS细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施？建立iPS细胞库（HLA多态性丰富的iPS细胞库），可以为需要的人找到HLA匹配度较高的iPS细胞。 16.如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？可以用来治疗不孕症，可以用来进行濒危物种的克隆，可以对获得的生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。 17.干细胞在医学上有着广泛的应用，其原因是：干细胞有自我更新能力及分化潜能，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。（P46“教材”） 18.科学家认为iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞，其原因是：iPS细胞的诱导过程无需破坏胚胎，而且iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。 二、动物细胞融合技术与单克隆抗体 （一）动物细胞融合技术 1．动物细胞融合技术概念：使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。 2.诱导的结果：形成的杂交细胞，具有原来两个或多个细胞的遗传信息。 3.诱导的原理：细胞膜具有一定的流动性。 4．诱导方法：PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等。其中，灭活病毒诱导法是动物细胞融合特有的诱导融合方法。 5．意义：突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。 6.“灭活病毒”中灭活的具体含义是什么？ 用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。 7.灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。 8.融合实质及完成的标志：细胞核的融合。 9．动物细胞融合技术的应用 (1)细胞融合技术成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。 (2)利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术，为制备单克隆抗体开辟了新途径。 10.动物细胞融合和植物体细胞杂交比较 项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合 原理 细胞膜具有一定的流动性 植物细胞的全能性 细胞膜具有一定的流动性 细胞融合前的处理方法 用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁 用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞 诱导细胞融合的方法 电融合法、离心法 、聚乙二醇（PEG）融合法 、高Ca2+高pH融合法 PEG融合法 、电融合法 、灭活病毒诱导法 细胞融合成功的标志 再生出细胞壁 细胞核 的融合 主要用途 获得完整的杂种植株 主要用于制造单克隆抗体 意义 打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种 突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能 （二）单克隆抗体及其应用 1.传统抗体的获得 （1）方法：向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。 （2）缺点：产量低、纯度低、特异性差。 2.单克隆抗体的制备：米尔斯坦和科勒由于发明了单克隆抗体的制备技术，于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖。 (1)制备原理： ①B淋巴细胞特点：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体；在体外培养条件下，一个B淋巴细胞不能(填“能”或“不能”)无限增殖。 ②骨髓瘤细胞特点：能(填“能”或“不能”)在体外大量增殖。 ③杂交瘤细胞及其特点：把一种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞进行融合，所得到的融合细胞就能大量增殖，产生足够数量的特定抗体。 （2）制备过程： 下图为单克隆抗体制备过程示意图，图中①处应填写B淋巴，该细胞是从小鼠脾脏中获取的，②过程为诱导融合的过程，该过程常用的有PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法（动物细胞特有）等，③处应填写杂交，④过程是选择培养的过程，该过程所用培养基为特定的选择培养基，⑤处应填写杂交瘤，该过程只能获得此类细胞的原因是在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。⑥过程是克隆化培养及抗体检测的过程，⑦过程是筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞，即抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞，此类细胞分泌的抗体能与特定抗原结合，⑧和⑨是获取抗体的两种途径，⑧指从培养注中获取，⑨是从小鼠腹水中获取。 （3）实验最初应如何处理小鼠？ 注射特定的抗原，用特定的抗原对小鼠进行免疫。目的是为了获得抗体吗？不是。其目的：用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞（获得能产生特定抗体的B淋巴细胞）。 （4）诱导融合后，能得到几种细胞？（融合只考虑两两融合） ①未融合的亲本细胞（B淋巴细胞、骨髓瘤细胞）。 ②融合的具有同种核的细胞（B-B细胞、瘤-瘤细胞）。 ③融合的杂交瘤细胞。 （5）筛选 第一次筛选 ①如何筛选（筛选方法）：用特定的选择培养基进行筛选。 ②筛选原理：在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。 ③获得的杂交瘤细胞的特点：既能迅速大量繁殖，又能产生抗体。此时，抗体不是所需的特定抗体。 ④得到的该杂交瘤细胞一定是所需的吗？ 杂交瘤细胞并不纯，因为从脾脏获得的B淋巴细胞不纯（既有未免疫的B淋巴细胞，又有能产其他抗体的B淋巴细胞，以及能产所需抗体的B淋巴细胞），因此要进行第二次筛选。 第二次筛选 ①如何筛选（筛选方法）：用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测（一般进行多次筛选）。 ②获得的杂交瘤细胞的特点：既能迅速大量繁殖，又能分泌所需抗体。 ③选择抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞，即分泌的抗体能与特定的抗原结合。 ④抗体检测原理：抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的检测）。 （3） 第一次筛选的目的：筛选获得杂交瘤细胞。 第二次筛选的目的：获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。 （6）如何对所需杂交瘤细胞大规模培养 在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖。 （7）如何获取单克隆抗体 ①体外培养：从细胞培养液中获取。 ②小鼠腹腔内培养：从小鼠腹水中获取。 （7）单克隆抗体制备的过程中涉及的原理：细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖。 （8）单克隆抗体制备的过程中应用到的技术：动物细胞融合、动物细胞培养。 （9）单克隆抗体的优点：能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备。（10）单克隆抗体的应用 ①作为诊断试剂，具有准确、高效、简易、快速的优点。 ②用于治疗疾病和运载药物。 用作诊断试剂的原理：单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合。 用作诊断试剂的实例：多种疾病的诊断和病原体鉴定。 与药物结合，制成__抗体-药物偶联物（ADC）__，杀伤癌细胞；ADC通常由_抗体_、__接头_和_药物_部分组成。 思考：下图为单克隆抗体制备流程(顺序已被打乱)，B图中小鼠注射的物质是特定抗原，其目的是刺激机体发生免疫应答，从而产生效应B淋巴细胞(浆细胞)。在获取C图中细胞时，被筛选淘汰的细胞类型有未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。这样，经筛选后，C图中细胞是由A和E细胞融合形成的，诱导这两种细胞的融合方法有聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒、电激等；融合的原理是细胞膜的流动性；D图中细胞的特点是既能无限增殖，又能产生特定的抗体；与普通血清抗体相比，F图中的抗体具有特异性强、灵敏度高、并可大量制备等特点。用箭头把代表各图解的字母按单克隆抗体制备过程的顺序连接起来： 。（P49“图2-16”改编） 三、动物体细胞核移植技术和克隆动物 1.动物细胞核移植技术概念及分类 （1）概念：动物细胞核移植技术是将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育为动物个体的技术。 （2）分类：哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植，动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植。在动物体细胞核移植中，非人灵长类动物的体细胞核移植非常困难。我国科学家经过多年努力，成功获得了体细胞克隆猴。 2.体细胞核移植的过程（以克隆高产奶牛为例） 动物细胞核移植技术原理：动物细胞核的全能性、细胞膜具有一定的流动性。动物细胞核移植技术生殖方式：无性生殖。哺乳动物核移植分类：胚胎细胞核移植和体细胞核移植。两者中难度较高的是体细胞核移植。 （1）动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植；为什么？ 动物胚胎细胞分化程度低，表现全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，表现全能性十分困难。 （2）非人灵长类动物体细胞核移植的困难原因 ①供体细胞的细胞核在去核卵母细胞中不能完全恢复其分化前的功能状态，这导致了胚胎发育率低； ②对非人灵长类动物胚胎进行操作的技术尚不完善。 （一）体细胞核移植的过程 下图为体细胞核移植的大致过程。图中序号①～⑧处应填空的内容依次为：①卵巢，②卵母细胞，③减数第二次分裂中期，④MⅡ中期卵母，⑤去核卵母，⑥供体细胞注入去核卵母细胞，⑦通过电刺激使两细胞融合，供体核进入受体卵母细胞，形成重构胚，⑧胚胎移植。通过⑦构建重组胚胎后，还需用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成细胞分裂和发育进程。 1.采集的卵母细胞应培养至MⅡ期（减数分裂Ⅱ中期） 2.选择MⅡ期卵母细胞的原因 （1）含有促进细胞核表现全能性的物质和营养条件。 （2）细胞体积大，易于操作。 3.卵母细胞去核 （1）卵母细胞去核的方法：显微操作（去核）法。 除此之外，还有梯度离心、紫外线短时间照射和化学物质处理等方法。这些方法是在没有穿透卵母细胞透明带的情况下去核或使其中的DNA变性。 （2）“去核”去的是什么？去除的为纺锤体-染色体复合物。 注意：去核时，由于MⅡ期卵母细胞核的位置靠近第一极体，一般用微型吸管一并吸出细胞核和第一极体。 （3）去核的原因：使核移植得到的胚胎或动物核内遗传物质全部来自有重要利用价值的动物。 （4）与直接注入核相比，将供体细胞注入卵母细胞的优点：对卵母细胞损伤较小。 注入位置：将供体细胞注入去核卵母细胞的透明带内（卵细胞膜和透明带之间）。 7.重组细胞 （1）诱导供体细胞和去核卵母细胞融合的方法：电融合法。 （2）融合的结果：供体核进入卵母细胞，形成重构胚。 8.重构胚 （1）重构胚概念：人工重新构建的胚胎，具有发育成完整个体的能力。 （2）激活重构胚的方法 ①物理方法：电刺激。 ②化学方法：Ca2+载体、乙醇和蛋白酶合成抑制。 （3）激活重构胚的目的：激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程。 9.实验结论：证明了动物已分化的体细胞的细胞核具有全能性。 10.实验结果：生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛 11.新生犊牛的细胞核遗传物质来自供体奶牛。 新生犊牛的细胞质遗传物质来自去核卵母细胞。新生牛的性别与供体奶牛一致。 12.通过动物细胞核移植获得奶牛的过程中涉及的技术： （1）动物细胞核移植。 （2）动物细胞培养。 （3）动物细胞融合。 （4）早期胚胎培养。 （5）胚胎移植。 注意：操作为“将供体细胞注入去核卵母细胞”时，才涉及该技术。 13.用上述技术培育的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？不是。 14.为什么克隆动物不是对体细胞供体动物进行了100%的复制？ （1）克隆动物绝大部分DNA来自供体动物的细胞核，但线粒体中的DNA（细胞质中的DNA）同时来自供体细胞和受体卵母细胞。 （2）性状是基因与环境共同作用的结果，克隆动物所处的环境与核供体细胞生活的环境不会完全相同。 （3）克隆动物在个体发育过程中有可能发生基因突变、染色体变异等可遗传变异。 （二）体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题 1．应用前景 (1)畜牧生产方面：加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育。 (2)医药卫生领域：通过建立转基因体细胞系，再利用体细胞核移植技术培育的转基因克隆动物可以作为生物反应器,生产许多珍贵的医用蛋白；在治疗人类疾病时，转基因克隆动物的细胞、组织或器官可以作为异种移植的供体；以患者作为供体培育的人核移植胚胎干细胞，经过诱导分化能形成相应的细胞、组织或器官，将它们移植给患者时可以避免免疫排斥反应。 (3)保护濒危物种方面：保护濒危物种，体细胞核移植有望增加濒危物种的存活数量。 (4)科研： ①研究克隆动物可使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程。 ②克隆一批遗传背景相同的动物，可以通过它们之间的对比来分析致病基因。 ③克隆特定疾病模型的动物，还能为研究该疾病机制和开发相应的药物提供帮助。 2．存在问题 (1)体细胞核移植技术的成功率非常低。 (2)各个技术环节有待进一步改进。 (3)克隆动物存在健康问题，表现出遗传和生理缺陷等 第3节　胚胎工程 一、胚胎工程的理论基础 1.胚胎工程概念：对生殖细胞、受精卵或早期胚胎细胞进行多种显微操作和处理，然后将获得的胚胎移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。胚胎工程技术包括体外受精、胚胎移植和胚胎分割等。研究胚胎工程，首先需了解哺乳动物受精和早期胚胎发育的规律。这是因为，胚胎工程的许多技术，实际是在体外条件下，对动物自然受精和早期胚胎发育条件进行的模拟操作。 2．胚胎工程技术 (1)操作对象：动物生殖细胞、受精卵、早期胚胎细胞； (2)特点：获得的胚胎需移植到雌性动物体内生产后代； (3)哺乳动物受精和早期胚胎发育的规律。 3.1890年，英国剑桥大学的生物学家将纯种安哥拉兔的两个4细胞胚胎移入一只纯种比利时兔的输卵管内，成功地产下两只纯种安哥拉子兔。这是世界上胚胎移植成功的首例，这个实验也首次证实了同种动物的胚胎在异体动物体内发育的可能性。 （一）受精 1．受精概念：精子与卵子结合形成合子(即受精卵)的过程。 2．受精场所：在自然条件下，哺乳动物的受精在输卵管内完成。 3．受精过程：包括受精前的准备阶段和受精阶段；前者又包括精子获能和卵子的准备。 （1）受精前的准备阶段 ①准备阶段1—精子获能：刚刚排出的精子，不能（能、不能）立即与卵子受精，必须在雌性动物生殖道发生相应的生理变化后，才能获得受精能力，这一生理现象称为“精子获能”。注意：获能的能指的是“受精能力”而不是“能量”。 ②准备阶段2—卵子的准备：卵子一般在排出后2-3h才能被精子穿入。动物排出的卵子成熟程度不同，可能是初级卵母细胞、次级卵母细胞，但它们都要在输卵管内进一步成熟，到MⅡ期时，才具备与精子受精的能力。 （2）受精阶段 ①精子穿越透明带等结构触及卵细胞膜。获能后的精子与卵子相遇时，首先它释放出多种酶,以溶解卵细胞膜外的一些结构，同时借助自身的运动接触卵细胞膜。在精子触及卵细胞膜的瞬间，卵细胞膜外的透明带会迅速发生生理反应，阻止后来的精子进入透明带。 ②精子入卵。精子入卵后，卵细胞膜也会立即发生生理反应，拒绝其他精子再进入卵内。 ③雌雄原核形成。精子入卵后，尾部脱离，原有的核膜破裂并形成一个新的核膜，最后形成一个比原来精子的核还大的核，叫作雄原核。与此同时，精子入卵后被激活的卵子完成减数分裂Ⅱ，排出第二极体后，形成雌原核。 ④受精卵形成。雄、雌原核充分发育后，相向移动，彼此靠近，核膜消失。这个含有两个染色体组的合子就是受精卵。 思考：1.下图一为哺乳动物成熟精子示意图，图中序号①处填写内容为线粒体鞘，图二为几种主要家畜的精子形态及大小示意图，由图二你可得出的与精子相关的结论是：不同种动物精子的形态相似，大小略有不同，与动物的体型大小无关，图三为卵子结构示意图，图中②～④处所填写内容依次为：透明带、卵细胞膜、第一极体。（P57“图2-19、2-20”改编） 思考：2.下图为哺乳动物受精示意图，请分别描述A、B、C过程及相关变化，过程A为精子与卵子相遇,精子释放多种酶,溶解卵细胞膜外的结构,穿越透明带；过程B为精子触及卵细胞膜,透明带发生生理反应,阻止后来的精子进入透明带；过程C为精子进入卵细胞膜,卵细胞膜发生生理反应,拒绝其他精子进入卵内。在C过程中，精子的核膜发生的变化是：核膜破裂形成新的核膜,最终形成的核比原来的精子的核大(填“大”“相等”或“小”),称为雄原核，即图中序号①，卵子发生变化是:完成减数分裂Ⅱ,排出第二极体,形成雌原核,即图中序号②。过程D发生的变化为雌雄原核相向移动,核膜消失,最终形成的含有两个染色体组的合子为受精卵。过程E受精结束,此时在卵细胞膜和透明带间有两个极体，受精卵开始发育。请你将图示受精过程用“文字、→”表示出来：精子卵细胞膜外的结构卵细胞雌、雄原核受精卵。受精的标志：a观察到两个极体；b观察到雌原核、雄原核。受精完成的标志：雌雄原核融合。 （二）胚胎早期发育 下图甲、乙、丙表示胚胎发育的具体阶段，①～⑦表示相关结构) 1.开始发育场所及分裂方式：受精卵形成后即在输卵管内进行有丝分裂，开始发育。 2.卵裂：胚胎发育早期，有一段时间是在透明带内进行分裂，细胞的数量不断增加，但胚胎的总体积并不增加，这种受精卵的早期分裂称为卵裂。 3.桑椹胚：当卵裂产生的子细胞逐渐形成致密的细胞团，形似桑椹时，这时的胚胎称为桑椹胚。 4.囊胚：上图中的乙表示囊胚。桑椹胚进一步发育，细胞逐渐分化。聚集在胚胎 一端的细胞形成内细胞团，即上图中序号②，内细胞团将来发育成胎儿的各种组织，而沿透明带内壁扩展和排列的细胞，称为滋养层细胞，即上图中序号③，它们将来发育成胎膜和胎盘。随着胚胎的进一步发育，胚胎的内部出现了含有液体的腔—囊胚腔，即上图中序号①，这个时期的胚胎叫做囊胚。囊胚进一步扩大，会导致透明带破裂，胚胎从其中伸展出来，这一过程叫作孵化。孵化非常重要，如果不能正常孵化，胚胎就无法继续发育。 5.原肠胚：囊胚孵化后，将发育形成原肠胚。原肠胚表面的细胞层为外胚层，向内迁移的细胞形成内胚层。随着发育的进行，一部分细胞还会在内、外两个胚层之间形成中胚层。这三个胚层将逐渐分化形成各种组织、器官等。 牛在自然情况下，胚胎最早可在8-16细胞阶段进入子宫，但在实践中通常对发育到囊胚阶段的胚胎进行移植的原因：提高移植后胚胎的发育率和妊娠率。 二、胚胎工程技术及其应用 胚胎工程技术目前在医学和生产上应用较多的是体外受精、胚胎移植和胚胎分割等，借助这些技术，可以进一步挖掘动物的繁殖潜力。 （一）体外受精 1．试管动物：通过人工操作使卵子在体外受精，经培养发育为早期胚胎后，再进行移植产生的个体。 2．体外受精技术的主要过程：卵母细胞的采集、精子的获取和受精。下图为哺乳动物体外受精过程示意图，图中①表示卵母细胞培养，②表示精子离心处理，③表示的细胞是MⅡ期卵母细胞，④精子获能处理，⑤表示体外受精，⑥表示受精卵培养。（P60“图2-22”改编） （1）采集到的卵母细胞和精子，要分别在体外进行成熟培养（即培养至MⅡ期）和获能处理（可对精子进行离心处理），然后才能用于体外受精。 （2）一般情况下，可以将获能的精子和培养成熟的卵子置于适当的培养液中共同培养一段时间，来促进它们完成受精。 3.体外受精的意义：是提高动物繁殖能力的有效措施，可以为胚胎移植提供可用胚胎。 （二）胚胎移植 1.概念：指将通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。其中提供胚胎的个体称为“供体”,接受胚胎的个体叫“受体”。 2.过程：以家畜的胚胎移植为例，胚胎移植主要包括供体、受体的选择和处理，配种或人工授精，胚胎的收集、检查、培养或保存，胚胎的移植，以及移植后的检查等步骤。以牛胚胎移植为例，其过程如下图所示。图中甲为优良供体母牛，一般具有遗传性状优良、生产能力强等特点。乙为受体母牛，有健康的体质和正常繁殖能力。丙为优良公牛，丁为具有优良性状的后代。过程①为进行同期发情处理、②为超数排卵处理、③为受体发情、④为发情配种或人工受精、⑤为收集胚胎并检查、⑥为胚胎移植、⑦为对受体进行妊娠检查。整个过程中提供胚胎的个体是甲，接受胚胎的个体乙。 3.优势：进行胚胎移植的优势是可以充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力。 4.胚胎来源：体外受精及其他方式得到的胚胎。 其他方式包括：体内受精、转基因技术、动物细胞核移植技术等。 5．胚胎移植的基本程序： （1）供体、受体的选择和处理。 ①提供胚胎的个体称为供体。 ②供体选择标准：遗传性状优良、生产能力强。 ③供体职能：产生具有优良遗传特性的胚胎。 ④接受胚胎的个体叫受体。 ⑤受体选择标准：有健康体质和正常繁殖能力。 ⑥受体职能：承担繁重而漫长的妊娠和育仔任务。 ⑦对受体进行的处理：同期发情处理。该处理的目的：为胚胎移植前后提供相同的生理环境。 ⑧只对供体进行的操作：超数排卵处理。该处理需要用的激素：外源促性腺激素。该处理的结果：卵巢排出比自然情况下更多的成熟卵子。 6.胚胎移植的地位：胚胎工程的最终技术环节。 7．胚胎移植的意义 (1)充分发挥雌性 优良个体的繁殖潜力。 (2)大大缩短了供体本身的繁殖周期。 (3)对供体施行超数排卵处理后，增加后代数量。 8.胚胎移植是如何充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力的？ 对供体施行超数排卵处理后，可获得多枚胚胎，经移植可得到多个后代，使供体生产下的后代数量是自然繁殖的十几倍到几十倍。 9.检查合格的胚胎移植到任何一个受体子宫内都能正常发育吗？不一定；需移植到同种的、生理状况相同的受体子宫内，胚胎才能继续发育。 10.胚胎移植前应该对受体进行怎样的处理？在胚胎移植前应该对受体进行同期发情处理，使供体和受体生殖器的生理变化同步，目的是为供体的胚胎移入受体提供相同的生理环境。 11.受体会不会对来自供体的胚胎（桑葚胚或囊胚）发生免疫排斥反应？不会。 12.胚胎移植后，经受体孕育的后代，其遗传特性与供体还是受体保持一致？为什么？供体；供体胚胎与受体子宫建立的仅是生理和组织上的联系，其遗传物质在孕育过程中不发生任何变化。 补充了解： 1.哺乳动物发情排卵后，不管是否妊娠，同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的。 意义：为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。 2.哺乳动物早期胚胎形成后，在一定时间内不会与母体子宫建立组织上的联系，而是处于游离状态。 意义：为胚胎的收集提供可能。 3.受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应。 意义：为胚胎在受体内的存活提供了可能）。 4.供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但移入受体的供体胚胎的遗传特性，在孕育过程中不受任何影响（即遗传物质不会发生改变）。 意义：为移植后的胚胎继续发育提供了营养等方面的保障，同时保留了遗传特性 （三）胚胎分割 1.胚胎分割概念：采用机械方法将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。 2.胚胎分割理论基础：早期胚胎干细胞具有很强的分裂能力，并保持着细胞全能性。 3.胚胎分割生殖方式：无性生殖（无性繁殖、克隆）。 4．胚胎分割的方法：机械方法。所需主要仪器设备：体视显微镜和显微操作仪。分割工具:分割针或分割刀。 5．操作对象及要求：选择发育良好、形态正常的桑葚胚或囊胚（原因：桑葚胚或囊胚的内细胞团细胞具有发育的全能性），将它移入盛有操作液的培养皿中，在显微镜下用分割针或分割刀分割。在分割囊胚阶段的胚胎时，要注意将内细胞团均等分割(原因：防止影响分割后胚胎的恢复和进一步发育)。 6.胚胎分割的操作环境：盛有操作液的培养皿，在显微镜下分割。 7.分割后胚胎去向：直接移植给受体或经体外培养后，再移植给受体。 8．胚胎分割的意义 (1)促进优良动物品种的繁殖，产生遗传性状相同的后代（具有相同的遗传物质）用于遗传学研究。 (2)在胚胎移植前，对胚胎进行性别鉴定（取样部位为滋养层，鉴定方法为做DNA分析）、遗传病筛查等，对于人工控制动物性别、动物繁育健康后代有重要意义。 9.胚胎移植的局限性：采用胚胎分割技术产生同卵多胎的可能性是有限的，分割次数越多，分割后胚胎成活的概率越小，目前仍然以二分胚胎的分割和移植效率最高。 10.利用核移植技术、体外受精（试管婴儿）、胚胎分割获得胚胎，生殖方式一样吗？不一样；核移植——无性生殖、体外受精——有性生殖、胚胎分割——无性生殖。 思考：下图为牛胚胎性别鉴定和分割示意图，图中①～④表示相关结构，相应序号表示的名称为①囊胚腔、②透明带、③滋养层、④内细胞团；甲、乙表示相关操作过程，甲表示做DNA分析，鉴定性别，该操作时应取样滋养层，乙表示胚胎移植。在获得图中二分胚时要注意的是将内细胞团均等分割，其原因是内细胞团是发育为胚胎本身的基础细胞，其他细胞为滋养细胞，只为胚胎和胎儿发育提供营养。若分割时不能将内细胞团均等分割，会出现含内细胞团多的部分正常发育的能力强，少的部分发育受阻或发育不良，甚至不能发育等问题。 错点1：误认为“具有全能性就是（就一定能）体现(实现)全能性” 精析：具有全能性：理论上，具有细胞核的活细胞都具有全能性；体现(实现)全能性：只有发育成完整个体或分化成其他各种细胞才能说明体现(实现)了细胞的全能性。 错点2：植物组织培养中的四个注意点 精析：①植物激素在植物组织培养中的作用: 生长素/细胞分裂素 植物细胞的发育方向 高 有利于根的分化、抑制芽的形成 低 有利于芽的分化,抑制根的形成 适中 促进愈伤组织的生长 简记为:“高”根,“低”芽,“中”愈伤 ②由愈伤组织进行细胞分化时,因为生根后不易再生芽,一般要先诱导其生芽,然后诱导其生根,可通过控制培养基中生长素和细胞分裂素的比例来实现。 ③光照:在诱导愈伤组织阶段,对有些植物来说,避光培养有利于细胞脱分化形成愈伤组织。当愈伤组织再分化出芽和叶时,一定要有光照,有利于叶片内叶绿素的合成。 ④植物组织培养中所需的碳源一般为蔗糖,且蔗糖溶液浓度略大于原生质体内的浓度，少数为葡萄糖和果糖,原因是蔗糖既可提供充足的碳源,又可维持相对适中的渗透压,而葡萄糖和果糖在与蔗糖提供相同数量碳源的前提下,其造成的渗透压可能过高。 错点3：有关植物体细胞杂交的6个易错点 精析：(1)误认为“植物体细胞杂交的结果只是形成杂种细胞”。植物体细胞杂交的结果最终要经过组织培养形成杂种植株。 (2)误认为“同种、不同种植物原生质体融合难易程度相同”。同种植物的原生质体更易融合,不同种植物原生质体的融合需要物理或化学法诱导。 (3)误认为“植物体细胞杂交属于有性生殖”。植物体细胞杂交过程中没有有性生殖细胞的结合，因此不属于有性生殖，应为无性生殖,遗传物质的传递不遵循孟德尔的遗传定律。 (4)误认为“杂种植株的变异类型属于基因重组”。杂种植株的染色体数通常是两亲本细胞染色体数目之和，属于异源多倍体，所以变异类型为染色体变异。 (5)误认为“植物体细胞整合后的都是杂种细胞”。AA和BB体细胞融合成功以后,不仅有AABB型杂种细胞,还能形成AAAA型和BBBB型融合细胞,但只有AABB型细胞是植物体细胞杂交所形成的杂种细胞,因此在杂种细胞形成后还应有一个筛选过程。 （6）误认为“植物组织培养和植物细胞融合的原理相同”。植物组织培养技术的原理是植物细胞的全能性，植物体细胞杂交的原理是细胞膜的流动性和植物细胞的全能性。 错点4：混淆脱毒苗与抗毒苗而出错 精析：脱毒苗是选择植物的分生区如茎尖(刚形成,不含有病毒)进行组织培养而获得的,属于细胞工程的范畴。抗毒苗是把某抗病毒基因导入受体细胞中,并通过一定的方法培养形成,属于基因工程的范畴。 错点5：植物组织培养与动物细胞培养的“有”与“没有”、“能”与“不能” 精析：(1)植物组织培养过程中有脱分化和再分化,而动物细胞培养过程中没有脱分化和再分化过程。 (2)植物组织培养能获得新个体,体现了细胞的全能性,而动物细胞培养只能得到细胞,不能体现细胞的全能性。 错点6：动物细胞培养中两组易错概念的辨析 精析：(1)细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞进行有丝分裂，数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。 (2)原代培养与传代培养。①原代培养：细胞悬液第一次在瓶中培养，没有分瓶培养之前的细胞培养。原代培养的细胞核型正常。②传代培养：原代培养的细胞生长、增殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭，影响细胞的生长，因此需要重新用胰蛋白酶等处理，进行分瓶扩大培养，即传代培养。一般情况下，细胞传至10～50代后，出现核型异常，细胞增殖会明显减缓，甚至完全死亡。 错点7：混淆了“悬浮生长和贴壁生长”细胞的培养方法而出错 精析：①悬浮生长细胞：原代培养→分裂受阻→离心法收集→制成细胞悬液传代培养。 ②贴壁生长细胞：原代培养→分裂受阻→胰蛋白酶处理→离心法收集→制成细胞悬液传代培养。 错点8：动物细胞培养过程中“酶”相关易错点 精析：①动物细胞培养过程中不同阶段使用酶的目的并不完全相同。动物细胞的整个培养过程中可能多次用到胰蛋白酶或胶原蛋白酶，第一次使用的目的是使组织细胞分散开，这样一方面保证细胞所需要的营养供应；另一方面能保证细胞内有害代谢物的及时排出；贴壁细胞传代培养时使用的目的是使细胞从瓶壁上脱离下来，分散成单个细胞，便于分瓶后继续培养。 ②使用酶处理时，并不是时间越长越好。使用胰蛋白酶时，要控制好作用时间，因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质，长时间作用还会分解细胞膜蛋白等，对细胞造成损伤。进行动物细胞培养时不能用胃蛋白酶分散细胞，主要是因为pH不合适。 错点9：混淆三种干细胞的来源及特点而出错 精析：三种干细胞的比较 比较 项目 胚胎干细胞 成体干细胞 诱导多能干细胞 来源 早期胚胎 成体组织或器官中 诱导高度分化的组织细胞形成 特点 具有分化成为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能 具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力 类似胚胎干细胞；诱导无需破坏胚胎，应用前景更广泛 错点10：混淆动物细胞整合与植物体细胞杂交的原理、方法及结果而出错 精析：动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较 比较 植物体细胞杂交 动物细胞融合 原理 细胞膜的流动性、细胞的全能性 细胞膜的流动性 步骤 酶解法去掉细胞壁后，诱导原生质体融合，形成杂种细胞，再经植物组织培养形成杂种植株 分散成单个细胞后诱导细胞融合，形成杂交细胞 方法 聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2＋—高pH融合法、电融合法、离心法 PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法 结果 形成杂种植株 形成杂交细胞，以生产细胞产品 意义 打破生殖隔离，实现远缘杂交育种 突破有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能 错点11：混淆单克隆抗体制备过程中两次筛选而出错 精析：单克隆抗体制备过程中两次筛选的比较 比较 第一次筛选 第二次筛选 筛选原因 诱导融合后得到多种融合细胞，还有未融合的细胞等 由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞 筛选目的 筛选出杂交瘤细胞 筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 筛选方法 用特定的选择培养基筛选；未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长 用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的细胞 错点12：对B淋巴细胞与骨髓瘤细胞经诱导处理后细胞种类判断错误 精析：B淋巴细胞与骨髓瘤细胞经诱导融合后，培养基中共出现5种细胞，其中融合的细胞有3种(如融合的话，只考虑两两融合)。 错点13：不明确去核的卵细胞在动物细胞核全能性的表达中的作用而出错 精析：细胞核全能性的表达，必须提供促进细胞核表达全能性的物质和营养条件，还要保证细胞的完整性，这样去核的卵细胞是最合适的受体细胞。因为卵细胞体积大、易操作，含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。该技术形成重组细胞发育成一个新个体，体现了动物细胞核的全能性而非动物细胞的全能性。 错点14：不明确核移植动物亲子代性状的关系而出错 精析：核移植中供体动物、提供卵母细胞的动物、代孕动物和克隆动物之间的关系：克隆动物绝大部分性状与供体动物相同，少数由线粒体DNA控制的性状与提供卵母细胞的动物相同，与代孕动物的性状无遗传关系。 错点15：误认为动物细胞培养时加入5%CO2的目的是维持气体平衡或用于呼吸 精析：动物细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶将其置于含95%空气加5% CO2的混合气体的培养箱中进行培养，加入CO2的目的是维持培养液的pH。 错点16：不清楚动物细胞克隆化培养时为何常选10代以内的细胞，而瘤细胞却为50代以后 精析：取供体动物的体细胞培养，一般选用传至10代以内的细胞，因为10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型，保证了供体细胞正常的遗传基础。欲获得无限增殖的瘤细胞则往往在50代以后，其遗传物质已发生变化，具癌变特性。 错点17：受精过程认识的“三个误区” 精析：(1)成熟的精子并不代表具有受精能力，必须获能后才具备受精能力。获能是指精子获得受精“能力”，而不是获得能量。 (2)雌、雄原核不能理解成卵子、精子原来的核，而是在原来细胞核的基础上形成的新核，原核膜已破裂。 (3)受精的标志≠受精完成的标志：受精的标志是观察到两个极体或雌、雄原核，受精完成的标志是雌、雄原核的融合。 错点18：混淆防止多精入卵的屏障及其意义而出错 精析：(1)防止多精入卵的两道屏障:精子接触卵细胞膜的瞬间,卵细胞膜外的透明带发生生理反应,阻止后来的精子进入透明带;精子入卵后,卵细胞膜立即发生生理反应,拒绝其他精子再进入卵内。 (2)这两道屏障可以保证受精卵中遗传物质与亲代体细胞一致,从而保证遗传的稳定性。 错点19：不能准确判断卵裂期胚胎发育过程中物质和体积变化而出错 精析：卵裂期胚胎发育过程中物质和体积变化的规律: (1)有机物:胚胎没有和母体建立联系,不能从母体获取有机物,而呼吸消耗一直进行,因此有机物总量减少。 (2)细胞数目和体积:胚胎总体积并不增加,但细胞数目增多,每个细胞体积减小。 (3)细胞中DNA含量:伴随细胞分裂,细胞数目增多,总DNA含量增多,但每个细胞中核DNA含量保持相对稳定。 错点20：误认为“所有采集的卵母细胞都必需培养才能成熟（MⅡ期）进而具备受精能力” 精析：从从输卵管中冲取的卵母细胞卵子,已发育至MⅡ期,可直接与获能的精子进行受精作用。卵巢中的卵母细胞为初级卵母细胞,需在体外培养至MⅡ期,才能进行体外受精。 错点21：混淆“自然受精、人工授精和体外受精” 精析：比较自然受精、人工授精和体外受精: 项目 自然受精 人工授精 体外受精 不 同 点 过程不同 雌雄动物交配完成 用人工的方法将公畜的精液注入母畜生殖道内,完成受精 人工获取精子、卵子,在体外培养液中完成受精过程 场所不同 雌性动物输卵管中 雌性动物输卵管中 体外培养液中 相同点 (1)精子获能、卵子成熟后方能完成受精过程;(2)都是有性生殖 强调：在填空书写中，必需注意“受、授”的区分。 错点22：不明确超数排卵处理中使用激素及其原理而出错 精析：超数排卵处理中使用的是促性腺激素而不是性激素,因为性激素是由性腺产生并释放的,长期使用外源性激素会导致性腺萎缩。促性腺激素由垂体产生并释放,作用于性腺,可以促进排卵,并且不会使性腺萎缩。 错点23：不明确胚胎移植的胚胎来源及生殖方式而出错 精析：胚胎移植的胚胎来源及生殖方式辨析 (1)核移植→早期胚胎培养,属于无性生殖。 (2)体外受精→早期胚胎培养,属于有性生殖。 (3)体内受精→冲卵→胚胎移植,属于有性生殖。 (4)胚胎分割→早期胚胎培养或胚胎移植,属于无性生殖。 错点24：不明确胚胎分割动物和体细胞核克隆动物的异同而出错 项目 胚胎分割动物 体细胞核克隆动物 相同点 都属于无性繁殖或克隆，最终技术是胚胎移植 不 同 点 胚胎来源 雌性动物的早期胚胎或体外受精及其他方式得到的胚胎 通过核移植技术获得的重组胚胎 遗传物质 胚胎分割动物具有相同的遗传物质，两个亲本提供的核遗传物质一样多 克隆动物的核遗传物质主要由供体细胞核提供 起点 经过受精作用或其他方式形成的一个细胞 经过核移植技术形成的一个细胞 错点25：滋养层≠饲养层 精析：(1)滋养层：囊胚时期沿透明带内壁扩展和排列的、个体较小的细胞，滋养层最终发育成胎膜和胎盘。 (2)饲养层：饲养层细胞一般为输卵管上皮细胞，在干细胞培养时，可作为提供干细胞分裂、增殖的营养细胞。 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！1 学科网（北京）股份有限公司 $$