3.4 蛋白质工程的原理和应用-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

第三章 基因工程 第4节 蛋白质工程的原理和应用 1 目录 /CONTENTS 01 蛋白质工程崛起的缘由 02 蛋白质工程的基本原理 03 蛋白质工程的应用 04 习题检测 学习目标： 1.说出蛋白质工程崛起的缘由。 2.概述蛋白质工程的基本原理。 3.举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程。 新课导入 下图是用发出不同颜色荧光的细菌“西画” 的美妙图案。这些细菌能够发出荧光，是因为在它们的体内导入了荧光蛋白的基因。 最早被发现的荧光蛋白是绿色荧光蛋白，科学家通过改造它，获得了黄色荧光蛋白等。 思考：那么，科学家是怎样对蛋白质分子进行设计和改造的呢? 3 目录 01 一、蛋白质工程崛起的缘由 一、蛋白质工程崛起的缘由 想一想：如何让细菌能发出荧光？ 荧光蛋白基因 细菌 荧光 蛋白 导入 荧光蛋白 基因表达 基因工程： 基因工程实质： 基因工程是将一种生物的 转移到另一种生物体内，使后者可以产生它原本不能产生的 ，进而表现出 。 基因 蛋白质 新性状 基因重组 5 一、蛋白质工程崛起的缘由 自然界中存在的荧光蛋白只有绿色荧光蛋白，能否通过基因工程，获得黄色荧光蛋白呢？ 不能 ①基因工程不足： 原则上只能生产自然界中已存在（天然）的蛋白质。 天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的 符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合 的需要。 ②天然蛋白质的不足: 结构和功能 人类生产和生活 蛋白质工程崛起的缘由 6 一、蛋白质工程崛起的缘由 对蛋白质分子的设计和改造是通过蛋白质工程来实现的。 蛋白质工程： 以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 ①基础： ②手段： ③结果： ④目的： 蛋白质的结构规律与生物功能关系 改造或合成基因 改造现有蛋白质或制造一种新的蛋白质 满足人类生产和生活需求 蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的，又叫作第二代基因工程。 思考：蛋白质工程是怎样进行的呢？基本原理是什么？ 7 一、蛋白质工程崛起的缘由 实例：提高玉米中赖氨酸的含量来满足人类生活需求。 蛋白质工程手段： 玉米中赖氨酸合成受两种关键酶：天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶影响，改造这两种酶，使赖氨酸含量提高。 天冬氨酸激酶 二氢吡啶二羧酸合成酶 + 赖氨酸合成 （＋） 赖氨酸含量达到一定浓度 （－） （－） 天冬氨酸激酶 二氢吡啶二羧酸合成酶 + 赖氨酸合成 （＋） 赖氨酸含量提高 第352位苏氨酸变成异亮氨酸 第104位天冬酰胺变成异亮氨酸 ↑5倍 ↑2倍 改 造 前 改 造 后 8 目录 02 二、蛋白质工程的基本原理 二、蛋白质工程的基本原理 ★1.蛋白质工程的目标 根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。 ★2.蛋白质工程的实质 通过改造或合成基因，来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质。 思考：蛋白质工程是直接对蛋白质分子进行改造吗？ 不是 10 一、蛋白质工程崛起的缘由 思考：为什么蛋白质工程改造基因而不是直接改造蛋白质？ 原因： ①任何一种天然蛋白质都是由　　 编码的，改造了　　 即对蛋白质进行了改造，而且可以遗传下去。 如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造的蛋白质也是无法遗传的。 ②对　 　进行改造比对蛋白质直接改造更容易操作，难度要小得多。 基因 基因 基因 11 二、蛋白质工程的基本原理 ★1.蛋白质工程的目标 根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。 ★2.蛋白质工程的实质 通过改造或合成基因，来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质。 3.天然蛋白质合成的过程 天然蛋白质合成的过程是按照中心法则进行的。 基因→表达（转录和翻译）→形成具有特定氨基酸序列的多肽链→形成具有高级结构的蛋白质→行使生物功能。 而蛋白质工程却与之相反！ 12 二、蛋白质工程的基本原理 目的基因 转录 mRNA 翻译 多肽链 折叠 蛋白质 （三维结构） 行使 生物功能 预期功能 设计 推测 改造或合成 ①预期蛋白质的功能 ②设计预期的蛋白质结构 ③推测应有的氨基酸序列 ④找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因 ⑤获得所需蛋白质 ★4.蛋白质工程的基本思路 13 二、蛋白质工程的基本原理 ★4.蛋白质工程的基本思路 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。 ①蛋白质工程是在分子水平上进行 ②蛋白质工程的基本思路是按照中心法则相反进行 14 ①预期蛋白质的功能 ②设计预期的蛋白质结构 ③推测应有的氨基酸序列 ④找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因 ⑤获得所需蛋白质 资料分析： 在正常人体内，血液中胰岛素的含量通常在进食后30-60分钟就达到高峰，而目前使用的基因工程生产的胰岛素制剂，注射120分钟才出现高峰。 科学家研究发现，天然胰岛素分子容易聚合成二聚体或六聚体，皮下注射胰岛素后往往需要经历一个逐渐解聚为单体的过程。 15 ①预期蛋白质的功能 ②设计预期的蛋白质结构 ③推测应有的氨基酸序列 ④找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因 ⑤获得所需蛋白质 利用X射线晶体衍射，核磁共振等技术手段，充分了解胰岛素的空间结构。 人胰岛素结构 16 ①预期蛋白质的功能 ②设计预期的蛋白质结构 ③推测应有的氨基酸序列 ④找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因 ⑤获得所需蛋白质 B28脯氨酸 B29赖氨酸 研究发现，调换胰岛素B链B28脯氨酸和29位B29赖氨酸，或者将B28脯氨酸替换为天冬氨酸，可以保持天然胰岛素的主要构象，同时能降低分子自聚力，显著抑制单聚体聚集，大大增加了吸收速率。 17 ①预期蛋白质的功能 ②设计预期的蛋白质结构 ③推测应有的氨基酸序列 ④找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因 ⑤获得所需蛋白质 天然胰岛素B链部分氨基酸序列： 酪氨酸 苏氨酸 脯氨酸 赖氨酸 苏氨酸 设计后胰岛素B链部分氨基酸序列： B28 B29 酪氨酸 苏氨酸 赖氨酸 脯氨酸 苏氨酸 B28 B29 思考：如何找到对应的脱氧核苷酸序列呢？ 18 ①预期蛋白质的功能 ②设计预期的蛋白质结构 ③推测应有的氨基酸序列 ④找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因 ⑤获得所需蛋白质 某多肽链的一段氨基酸序列是： 丙氨酸 色氨酸 赖氨酸 谷氨酸 苯丙氨酸 … … 查密码子表 思考：mRNA序列有几种 脱氧核苷酸序列有？ 4×1×2×2×2 = 32种 32种 19 ①预期蛋白质的功能 ②设计预期的蛋白质结构 ③推测应有的氨基酸序列 ④找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因 ⑤获得所需蛋白质 某多肽链的一段氨基酸序列是： 丙氨酸 色氨酸 赖氨酸 谷氨酸 苯丙氨酸 … … 查密码子表 ……-丙氨酸-色氨酸-赖氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-…… 氨基酸序列： GCU(或C或A或G) UGG AAA(或G) GAA(或G）UUU(或C) mRNA序列： 脱氧核苷酸序列： GCT(或C或A或G) TGG AAA(或G) GAA（或G） TTT(或C) CGA(或G或T或C) ACC TTT(或C) CTT（或C） AAA(或G) 20 ①预期蛋白质的功能 ②设计预期的蛋白质结构 ③推测应有的氨基酸序列 ④找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因 ⑤获得所需蛋白质 脱氧核苷酸序列： GCTTGGAAAGAATTT CGAACCTTTCTTAAA 思考1：确定目的基因的碱基序列后怎样才能合成或改造目的基因？ （1）确定目的基因的碱基序列后，可以人工合成目的基因，或从基因文库中获取、PCR技术扩增； （2）应用基因定点突变技术来进行碱基的替换、增添等进而改造基因； 思考2：然后如何获得所需蛋白质呢？ 改造后得到的基因序列通过PCR扩增后，通过基因工程技术获得转基因生物。从而生产出所需蛋白。 21 二、蛋白质工程的基本原理 补充：基因的定点突变技术——重叠延伸PCR技术 ①该过程需要______种引物； ②PCR1的产物AB是引物___和引物___扩增的结果； ③PCR2的产物CD是引物___和引物___扩增的结果； ④产物AD的形成需要引物吗？___________________________________ ⑤需要改变的碱基位于引物___和引物___上 ⑥引物b和引物c之间有什么关系？__________________________________ ⑦PCR3中突变产物AD的扩增需要引物___ 和引物___ 4 a b c d b c 引物b和引物c应有部分碱基互补的关系 a d 不需要，但需要耐高温的DNA聚合酶 22 二、蛋白质工程的基本原理 补充：基因的定点突变技术——重叠延伸PCR技术 重叠延伸PCR技术：一项重要的基因定点突变技术，其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。 23 二、蛋白质工程的基本原理 补充：基因的定点突变技术——重叠延伸PCR技术 24 二、蛋白质工程的基本原理 补充：基因的定点突变技术——重叠延伸PCR技术 (1)由以上事例可知，要对蛋白质的结构进行改造，需要通过__________ _______________来完成。 (2)若拟突变位点的碱基对为A—T，则需要让其突变为____________才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为_______(假设引物为单链DNA)。 改造基因 (基因定点突变) T—A或C—G A或G 25 二、蛋白质工程的基本原理 补充：基因的定点突变技术——重叠延伸PCR技术 (3)在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生____种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为__________________________________________________________________________________ 3 引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用。 26 二、蛋白质工程的基本原理 补充：基因的定点突变技术——重叠延伸PCR技术 (4)利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时，特别要注意的问题是_________________________________________________________________________________。 M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段 27 二、蛋白质工程的基本原理 (1)代表蛋白质工程操作思路的过程是________；代表中心法则内容的是__________。(填写数字) (2)写出图中各数字代表的生物学过程的名称或内容： ①______； ②______；③______；④______；⑤__________。 (3)蛋白质工程的目的是_______________________________ ___________________________，通过____________________实现。 (4)从图中可以看出蛋白质工程的基本途径与中心法则是______的。 ④⑤ ①②③ 转录 翻译 折叠 推测 改造合成 根据人们对蛋白质功能的特定需求， 基因改造或基因合成 相反 对蛋白质的结构进行分子设计 例：下图为蛋白质工程操作的基本思路，请据图回答下列问题： 28 目录 03 三、蛋白质工程的应用 三、蛋白质工程的应用 1.医药工业方面 （1）研发速效胰岛素类似物 天然蛋白质易形成二聚体或六聚体 预期功能 降低胰岛素的聚合作用 设计结构 改变B链第20～29位氨基酸组成 改造 新胰岛素基因 B28位脯氨酸替换为天冬氨酸或将它与B29位的赖氨酸交换位置 推测序列 转录 mRNA 翻译 多肽链 行使功能 速效胰岛素类似物 预期结构 折叠等 阻碍胰岛素从注射部位进入血液，延缓了降血糖作用 30 三、蛋白质工程的应用 1.医药工业方面 （2）延长干扰素体外保存时间 干扰素 （半胱氨酸） 干扰素 （丝氨酸） 改造 UGU、UGC AGU、AGC DNA mRNA TGT(或C) ACA(或G) AGT(或C) TCA(或G) 对编码干扰素分子的基因进行改造时，利用什么技术进行碱基的替换？ 基因定点突变技术 干扰素是人或动物体内的一种蛋白质，可以用于治疗病毒的感染和癌症。但在体外保存相当困难。如果将其分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，那么在零下70℃的条件下，可以保存半年。 31 三、蛋白质工程的应用 1.医药工业方面 （2）延长干扰素体外保存时间 干扰素是人或动物体内的一种蛋白质，可以用于治疗病毒的感染和癌症。但在体外保存相当困难。如果将其分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，那么在零下70℃的条件下，可以保存半年。 天然干扰素不易保存 改造 新干扰素基因 预期功能 延长保存时间 设计结构 氨基酸替换 一个半胱氨酸变成丝氨酸 推测序列 预期结构 转录 mRNA 折叠 翻译 多肽链 行使功能 在-70℃下可以保存半年 32 三、蛋白质工程的应用 1.医药工业方面 （3）降低人对小鼠单抗隆抗体的免疫反应 小鼠单克隆抗体会使人产生免疫反应，降低治疗效果。 科学家通过改造基因，将小鼠单克隆抗体上结合抗原的区域（即可变区）“嫁接”到人的抗体（即恒定区）上，降低了诱发人体免疫反应的强度。 33 三、蛋白质工程的应用 1.医药工业方面 （4）提高蛋白质的热稳定性 第3位上的 异亮氨酸 半胱氨酸 与第97位的半胱氨酸形成-s-s- 34 三、蛋白质工程的应用 2. 其他工业方面 广泛用于改进酶的性能或开发新的工业用酶。 如枯草杆菌蛋白酶具有水解蛋白质的作用，常被用于洗涤剂工业、丝绸工业等。迄今为止，利用蛋白质工程获得的该酶的突变体已有上百种，从中可能筛选出一些符合工业化生产需求的突变体，从而提高这种酶的使用价值。 枯草杆菌蛋白酶 35 三、蛋白质工程的应用 3. 农业方面 （1）科学家正在尝试改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用的效率，增加粮食的产量。 36 三、蛋白质工程的应用 3. 农业方面 （2）科学家利用蛋白质工程的思路设计优良微生物农药，通过改造微生物蛋白质的结构，使它防治病虫害的效果增强。 设计优良微生物农药（如苏云金杆菌-Bt杀虫蛋白） 伊维菌素是新型的广谱、高效、低毒抗生素类抗寄生虫药 37 二、蛋白质工程的基本原理 蛋白质工程是一项难度很大的工程 蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往十分复杂。目前对其了解还很不够，还需探索。 要设计出更符合人类需要的蛋白质还需不断地攻坚克难。随着科技的发展，蛋白质工程将会给人带来更多的福祉。 ① 面临的问题 ★② 难度大的原因 前景展望 ４. 蛋白质工程面临的问题 38 三、蛋白质工程的应用 比较项目 蛋白质工程 基因工程 相同 操作对象 操作水平 区别 操作流程 结果 实质 联系 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 通过改造或合成基因定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的新的生物类型和生物产品 创造出自然界不存在的蛋白质 生产出自然界已有的蛋白质 蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程 基因 DNA分子水平 39 三、蛋白质工程的应用 是否合成新的基因 蛋白质工程 是否对原有基因进行改造 是 否 是 否 蛋白质工程 基因工程 看蛋白质 看基因 是否为天然蛋白质 是 否 蛋白质工程 基因工程 思考：如何判断一个操作过程是基因工程技术还是蛋白质工程技术？ 40 三、蛋白质工程的应用 蛋白质工程 理论基础 技术手段 目标 基本思路 实践应用 蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系 通过改造或合成基因,来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质 根据人们对蛋白质功能的特定需求,对蛋白质的结构进行设计改造 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。 药物研发 改进酶的性能或开发新的工业用酶 增加粮食产量、研发新型农药 41 习题检测 (1)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质(　　) (2)对蛋白质的改造是通过直接改造相应的mRNA来实现的(　　) (3)由于蛋白质中氨基酸的排列顺序千变万化，空间结构千差万别，蛋白质工程操作难度很大(　　) (4)蛋白质工程不能改变蛋白质的活性(　　) √ × × √ 习题检测 一、概念检测 1.蛋白质工程可以说是基因工程的延伸。判断下列相关表述是否正确。 （1）基因工程需要在分子水平对基因进行操作，蛋白质工程不需要对基因进行操作（ ） （2）蛋白质工程需要改变蛋白质分子的所有氨基酸序列。 （ ） （3）蛋白质工程可以改造酶，提高酶的热稳定性。 （ ） × × √ 习题检测 2. 蛋白质工程是在深入了解蛋白质分子的结构与功能关系的基础上进行的，它最终要达到的目的是 （ ） A.分析蛋白质的三维结构 B.研究蛋白质的氨基酸组成 C.获取编码蛋白质的基因序列信息 D.改造现有蛋白质或制造新的蛋白质，满足人类的需求 D 习题检测 3. 水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。研究人员发现，用赖氨酸替换水蛭素第 47位的天冬酰胺可以提高它的抗凝血活性。在这 项替换研究中，目前可行的直接操作对象是（ ） A.基因 B.氨基酸　　 C.多肽链 D.蛋白质 A 习题检测 水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓，但在治疗过程中发现其抗凝血活性低。研究人员欲提高水蛭素抗凝血活性，正确的操作步骤是（ ） ①确定影响活性的氨基酸序列 ②分析水蛭素的空间结构，找到影响其活性的结构域 ③推测需要替换的氨基酸序列 ④构建表达载体，使其在受体细胞中表达 ⑤PCR技术获得改造后的水蛭素基因 ⑥确定基因中的碱基序列 A.②①③⑤⑥④ B.②③⑥①⑤④ C.②①③⑥⑤④ D.①②③④⑤⑥ C 习题检测 二、拓展检测 T4溶菌酶是一种重要的工业用酶，但是它在温度较高时容易失去活性。为了提高T4溶菌酶的耐热性，科学家首先对影响T4溶菌酶耐热性的一些重要结构进行了研究。然后以此为依据对相关基因进行改造，使T4溶菌酶的第3位异亮氨酸变为半胱氨酸。于是，在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，T4溶菌酶的耐热性得到了提高。这项工作属于什么工程的范畴？在该实例中引起T4溶菌酶空间结构发生改变的根本原因是什么？如果要将该研究成果应用到生产实践，还需要做哪些方面的工作？ 这项工作属于蛋白质工程的范畴。引起T4溶菌酶空间结构发生改变的根本原因是基因的碱基序列发生了变化。如果要将改造后的T4溶菌酶应用于生产实践,还有很多工作需要做。例如由于改造后酶的空间结构发生了变化,因此它的一些基本特性需要重新明确,包括它能耐受的温度范围、催化反应的最适温度、酶活力的大小等;需要建立规模化生产该酶的技术体系,评估生产成本等。 $$