专题一 发酵工程与基因工程（期末考点串讲）-2023-2024学年高二生物下学期期末考点大串讲（人教版2019）

举一反三 典例精讲 考点梳理 思维导图 发酵工程与基因工程 专题一 考点串讲PPT 目 录 CONTENTS 1 传统发酵技术的应用 5 6 基因工程的应用 基因工程的基本操作程序 2 微生物的培养及应用 3 酶的研究与应用 4 基因工程的基本工具 7 蛋白质工程 思维导图 传统发酵技术的应用 考点01 考点01 传统发酵技术的应用 考点梳理 一、果酒果醋的制作 项目 果酒制作 果醋制作 菌种 酵母菌 醋酸菌 菌种来源(自然发酵) 附着在葡萄皮上的野生型酵母菌 酒变酸后表面的菌膜 发酵过程 ①有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖： ②无氧条件下，酵母菌进行无氧呼吸，产生酒精： ①当氧气、糖源充足时，醋酸菌将糖分解成醋酸： ②当糖源不足、氧气充足时： 条件 温度 酿酒酵母：28℃；野生酵母：18~30℃ 30~35℃ 气体 前期需氧，后期无氧 需氧 时间 10-12d 7-8d 5 考点01 传统发酵技术的应用 考点梳理 一、果酒果醋的制作 (1)材料的选择与处理 选择新鲜的葡萄,榨汁前先将葡萄进行冲洗，再除去枝梗和腐烂的籽粒，以防葡萄汁流失及被污染。冲洗以洗去灰尘为目的,不要冲洗次数过多，以防洗去野生型酵母菌。 (2)防止发酵液被污染 ①榨汁机和发酵瓶等都需清洗干净并进行消毒；②清洗葡萄时要先清洗后除枝梗和腐烂的籽粒；③发酵瓶排气管用曲颈管而不用直管。 (3)控制发酵条件 ①葡萄汁装入发酵瓶时,要留约1/3的空间，目的是先让酵母菌进行有氧呼吸,快速繁殖,耗尽O2后再进行酒精发酵，并防止发酵过程中产生的CO造成发酵液的溢出。 ②严格控制温度：18~25‘C利于酵母菌的繁殖和酒精发酵；30~35‘C 利于醋酸菌的繁殖和果醋的发酵。 ③充气：酒精发酵为无氧发酵，需关闭充气口；醋酸发酵为有氧发酵，需打开充气口充气。 6 考点01 传统发酵技术的应用 考点梳理 二、腐乳的制作 蛋白质 脂肪 小肽 氨基酸 甘油 脂肪酸 酵母、曲霉和毛霉等多种微生物 + + 蛋白酶 脂肪酶 (毛霉起主要作用) 让豆腐长出毛霉 直接利用空气中的毛霉孢子或者直接接种毛霉（15-18℃，一定湿度） 目的：让毛霉等产生蛋白酶和脂肪酶 加盐腌制 目的：析出豆腐中的水分、抑制不需要的微生物生长 加卤汤装瓶 卤汤包括酒和香辛料 酒（12%）：抑制微生物生长，并使腐乳具有独特香味； 香辛料：调味，防腐杀菌。 密封腌制 卤汤中酒的含量在12%左右的原因：过高会延长腐乳成熟的时间，过低不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐败。 方法：随豆腐层数加高增加盐用量，接近瓶口表面，铺厚一点 7 考点01 传统发酵技术的应用 考点梳理 三、泡菜的制作 乳酸菌 ①菌种来源： 植物体表面天然的乳酸菌 ②代谢类型： 异养厌氧型 ③种类： 乳酸链球菌、乳酸杆菌 （原核生物） 在无氧的情况下能将葡萄糖分解成乳酸 C6H12O6 ——→2C3H6O3（乳酸）+能量 酶 发酵期间，乳酸会_________，当它的质量百分比为_____________时，泡菜的口味、品质最佳。 2.原理: 1.菌种: 不断积累 0.4%-0.8% 3.注意事项: （1）泡菜坛的选择： 坛沿深、盖子吻合好 无裂纹、无砂眼 火候好 检查方法：可将坛口向上压入水中，看看坛内有无渗水现象。 （2）腌制的条件： ①要注意控制时间、温度和食盐的用量。 ②温度过高、食盐用量过低、腌制时间过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。 8 考点01 传统发酵技术的应用 考点梳理 三、泡菜的制作 配制 盐水 蔬菜处理装坛 加盐水 封坛 发酵 过高：乳酸发酵受抑制，泡菜风味差； 过低：杂菌易繁殖，导致泡菜变质。 杀菌、除氧 泡菜发酵初期，大肠杆菌、酵母菌等较为活跃，产生较多的CO2，防止发酵液溢出坛外； 防止因太满使盐水未完全淹没菜料而导致菜料变质腐烂； 留有一定空间，方便拿取泡菜。 将新鲜蔬菜洗净，切成块状或条状，混合均匀，晾干后装入泡菜坛内；装至半坛时，加入蒜瓣、生姜及其他香辛料，继续装至八成满； 创造无氧环境 将冷却好的盐水缓缓倒入坛中，使盐水没过菜料，盖好坛盖； 向坛盖边缘的水槽中注满水，在发酵过程中注意向水槽中补充水；根据室内温度控制发酵时间； 不影响乳酸菌的生命活动 用清水和食盐配制质量百分比为5%-20%的盐水，并将盐水煮沸，冷却待用； 9 考点01 传统发酵技术的应用 典例精讲 【典例01】图甲是果酒和果醋发酵的装置图，图乙是果酒和果醋制作过程中发生的物质变化。下列叙述不正确的是( ) A.用甲装置制作果酒时，加入酵母菌后，一直关紧阀a，适时打开阀b几秒钟 B.用甲装置制作果醋时，阀a要关闭，阀b要持续打开 C.乙图中过程②只能发生在缺氧条件下 D.过程③和④都需要氧气的参与 B 解析：制作果醋需要的微生物是醋酸菌，醋酸菌是好氧菌，所以阀a需要全程打开，阀b也需要全程打开。（若此选项换为乙醇发酵，则需要的是酵母菌，酵母菌属于兼性厌氧菌，无氧呼吸产生酒精，所以阀a需要全程关闭，阀b需要间断打开排气）所以B错误。 10 考点01 传统发酵技术的应用 典例精讲 【典例02】以下是以泡菜坛为容器制作泡菜的过程：①沸盐水冷却后倒入坛中，浸没全部菜料；②盖好坛盖后，向坛盖边沿的水槽中注满水；③检测泡菜中亚硝酸盐的含量。相关叙述正确的是（　　） A．①过程中沸盐水冷却为了防止醋酸菌被杀死 B．②过程的主要目的是为避免杂菌污染 C．③的检测结果是亚硝酸盐含量逐渐降低 D．过程①②③不必在无菌环境下进行 D 解析： A、①盐水煮沸是为了灭菌，冷却之后使用是为了保证乳酸菌等微生物生命活动不受影响，A错误; B、③盖好坛盖后，向坛盖边沿的水槽中注满水，主要是为了隔绝空气，为乳酸菌提供无氧环境，B错误；C、③检测泡菜中亚硝酸盐的含量，腌制泡菜过程中亚硝酸盐的含量先增多后减少，C错误; D、过程①目的是杀菌，②创造无氧环境，③对亚硝酸盐的含量进行检测，三者皆不必在无菌环境下进行。 11 考点01 传统发酵技术的应用 举一反三 【演练01】下列有关腐乳制作的叙述中，正确的是（　　）①在腐乳制作过程中必须有能产生蛋白酶的微生物参与；②用含水量过高的豆腐制腐乳，不易成形；③腐乳外部有一层致密的“皮”，对人体是有害的；④腐乳制作后期酒精含量过低使腐乳成熟时间延长；⑤装瓶密封瓶口时，最好进行灼烧灭菌，以防止瓶口污染；⑥可用豆腐本身渗出的水加盐腌制成绵软油滑、异臭奇香的青方腐乳 A．①②③⑤ B．②③④⑤ C．①②⑤⑥ D．②④⑤⑥ C 【演练02】南通某兴趣小组按下图流程制作苹果醋。相关叙述正确的是（    ） A．菌种甲、乙都具有线粒体，都能进行有氧呼吸 B．加糖的目的是直接为菌种甲、乙提供碳源和能源 C．菌种甲、乙发酵过程中，发酵液pH下降、温度上升 D．发酵结束后取苹果醋加酸性重铬酸钾检测发酵效果 C 12 微生物的培养及应用 考点02 考点02 微生物的培养及应用 考点梳理 一、培养基的营养成分 一般都含有碳源、氮源、水、无机盐 碳源 无机碳源：CO2、CO32-、HCO3- 有机碳源：糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油等 自养微生物 异养微生物 功能：①构成细胞物质和一些代谢产物②有机碳既是碳源又是能源。 氮源 无机氮源：NH4＋、NO3-、NH3等 有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等 功能：主要用于合成蛋白质、核酸及含氮代谢产物等。 含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源。 无机盐 功能：提供无机营养；调剂PH；维持渗透压 水 功能：良好的溶剂；维持生物大分子结构的稳定 14 考点02 微生物的培养及应用 考点梳理 二、无菌技术的类型 类型 适用范围 操作方法 消 毒 灭 菌 较为温和理化方法，杀死部分微生物 强烈的理化方法，杀死所有微生物(包括芽孢、孢子) 煮沸消毒法 日常生活 100 ℃煮沸5～6 min 巴氏消毒法 不耐高温的液体 62～65 ℃煮30 min或80-90 ℃煮30s-1 min 化学药剂 生物活体、水源等 擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源 紫外线 紫外线照射30 min 灼烧灭菌 接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等 直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧 干热灭菌 耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等 物品放入干热灭菌箱,160～170 ℃加热2～3h 湿热灭菌 培养基等,生产和实验室常用 高压蒸汽灭菌锅内,100 kPa,温度121℃, 15～30 min 接种室、实验室、超净工作台 15 考点02 微生物的培养及应用 考点梳理 三、纯培养的步骤 倒平板 待培养基冷却至50 ℃左右，酒精灯火焰附近倒平板；平板冷凝后，要将平板倒置。 ①温度过高不安全（烫手），温度过低培养基会凝固； ②可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。 通过灼烧灭菌，防止瓶口微生物污染培养基。 防止培养基表面的水分过度挥发;防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 鉴定：将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。 ①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红 ⑥将皿盖打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划3-5条平行线，盖上皿盖。 ⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞 ②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞 ③试管口通过火焰 ④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液 ⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。 16 考点02 微生物的培养及应用 考点梳理 四、微生物的计数 主要方法 稀释涂布平板法 平板划线法 主要步骤 接种工具 菌体获取 能否计数 共同点 系列梯度稀释操作和涂布平板操作 接种环在固体培养基表面连续划线 涂布器 接种环 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体 在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板 不能计数 使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体——菌落 稀释涂布平板计数法 M代表稀释倍数 C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL) 每g样品中的菌落数＝ (C÷V)×M 显微镜直接计数法 血细胞计数板 常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。 细菌计数板 对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 快速、直观 A.不能区分死菌和活菌→偏大 B.不适于对运动细菌的计数。 C.个体小的细菌在显微镜下难以观察。 优点 缺点 17 考点02 微生物的培养及应用 典例精讲 【典例01】下列有关培养基的叙述，正确的是( ) A.微生物的培养都需要提供水、碳源、氮源、无机盐，缺一不可 B.微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的单个细菌 C.培养细菌时，需要将培养基调至中性或弱碱性 D.培养基只能培养细菌 C 解析：A、微生物的培养不一定都需要提供水、碳源、氮源、无机盐，如培养自生固氮菌时不需要加入氨源，A错误； B、微生物在固体培养基上生长时，可形成肉眼可见的菌落，单个细菌不能用肉眼看到，B错误； C、不同微生物对培养基中的pH的要求不同，培养细菌时，需要将培养基调至中性或弱碱性，C正确； D、培养基能培养细菌，也能培养真菌，D错误。 18 考点02 微生物的培养及应用 典例精讲 【典例02】取纯净微生物的关键在于无菌技术，主要包括消毒和灭菌。下列关于无菌技术的叙述错误的是（ ） A．牛奶一般通过100℃煮沸5~6min来消毒 B．紫外线照射30min可以杀死物体表面的微生物 C．吸管和培养皿通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌 D．接种环、试管口通过灼烧灭菌法进行灭菌 A 解析：A、牛奶不耐高温，牛奶的消毒应采用巴氏消毒法，即在62-65°C条件下消毒30分钟或在80-90°C条件下处理30s~1分钟，A错误; B、接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可用紫外线照射30min进行消毒，以杀死物体表面或空气中的微生物，B正确； C、吸管和培养血通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，也可用干热灭菌法进行，C正确； D、接种环、试管口等实验中频繁使用的常使用灼烧灭菌法，D正确。 19 考点02 微生物的培养及应用 举一反三 【演练01】下列关于倒平板的叙述，错误的是( ) A.待培养基冷却至50 ℃左右时倒平板 B.倒平板整个过程应在酒精灯火焰旁进行 C.完全打开培养皿皿盖，右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖 D.为避免水滴滴入培养基，平板应倒过来放置 C 【演练02】下图为微生物平板划线示意图，划线的顺序为1、2、3、4、5，下列叙述正确的是( ) A.在每一区域内划线时接种环上的菌种直接来源于 菌液 B.划线操作时应在酒精灯火焰旁边打开皿盖放在桌面 上，划线接种 C.每次划线只能从上一次划线的末端开始，才能确保 菌种逐步稀释以得到单菌落 D.第1区和第5区的划线最终要连接起来，以便比较前后的菌落数 C 20 酶的研究与应用 考点03 考点03 酶的研究与应用 考点梳理 一、固定化计数比较（拓展） 名称 原理 图示 包埋法 将酶或细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中 化学结合法 利用共价键、离子键将酶分子或细胞相互结合，或将其结合到纤维素、琼脂糖等载体上 物理吸附法 通过物理吸附作用，把酶或细胞固定在活性炭、多孔玻璃等吸附剂表面 22 考点03 酶的研究与应用 考点梳理 二、直接使用酶、固定化酶、固定化细胞比较（拓展） 直接使用酶 固定化酶 固定化细胞 酶的种类 一种或几种 一种 一系列 适用方法 化学结合法、物理吸附法 包埋法 营养物质 不需要 不需要 需要 反应底物 各种物质 (大分子、小分子) 各种物质 (大分子、小分子) 小分子物质 优点 催化效率高、耗能低、污染小 酶既能与反应物结合，又能与产物分离，还可以被反复利用 成本更低，操作更容易 缺点 对环境条件非常敏感，易失活；难回收，提高了成本，影响产品质量 不适用于催化一系列的酶促反应 反应物不易与酶接触，尤其是大分子，反应效率下降 23 考点03 酶的研究与应用 典例精讲 【典例01】研究人员从土样中筛选出产果胶酶的菌株XW-18，研究不同碳源对XW-18的生长和果胶酶活性的影响，结果如下图。以下叙述错误的是（    ） A．若要筛选产果胶酶的菌株，应以果胶作为唯一碳源 B．碳源越能促进XW-18的增殖，则果胶酶产量就越高 C．若要以XW-18发酵生产果胶酶，应该以蔗糖作为碳源 D．若要让XW-18扩大培养，应该以可溶性淀粉作为碳源 B 解析：A、果胶酶能水解果胶，以果胶作为唯一碳源，能筛选出产果胶酶的菌株，A正确； B、一般来说碳源越能促进xW-18的增殖，则果胶酶活性就越高，但是图中以可溶性淀粉为碳源时，菌体量最大，而酶活性相对较低，因此两者之问不能说成正相关的关系，B错误; C、若要以xW-18发酵生产果胶酶，应以蔗糖作为碳源，此条件下酶活性最高，菌株量也相对较多，C正确； D、若要让xW-18扩大培养，应该以可溶性淀粉作为碳源，此时菌体数量最多，D正确。 24 考点03 酶的研究与应用 典例精讲 【典例02】下列关于果胶酶的叙述，错误的是（　　） A．果胶酶能提高水果的出汁率，并使果汁变得澄清 B．食品加工中果胶酶主要是由植物中提取产生 C．酶的反应速度可以用单位时间内、单位体积反应物的减少量来表示 D．果胶酶包含多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和果胶酯酶 B 解析：A、植物细胞壁的成分主要是纤维素和果胶，果胶酶可以分解果胶，瓦解植物细胞的细胞壁和胞间层，从而提高水果出汁率并使果汁变得澄清，A正确； B、食品加工中果胶酶主要是由霉菌发酵生产，B错误; C、酶的反应速度可以用单位时问内、单位体积反应物的减少量或者产物的增加量来表示，C正确; D、果胶酶是能分解果胶的一类酶的总称，包含多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和果胶酯酶，D正确。 25 考点03 酶的研究与应用 举一反三 【演练01】下列有关固定化酶的说法正确的是（　　） A．固定的酶可以长期永久使用 B．使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时还可以反复利用 C．固定后的酶可以不受强酸强碱和高温的限制 D．生产高果糖浆时，固定化酶反应柱底端分布着许多小孔的筛板属于半透膜 B 【演练02】某学习小组欲探究果胶酶用量对橙汁产量的影响，实验结果如图所示。有关实验的分析正确的是（    ） A．果胶酶的单体是半乳糖醛酸，包含多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶、果胶酯酶等 B．该实验的无关变量有温度、pH和果胶酶用量等 C．实验过程中玻璃棒搅拌的目的是增大溶液中的溶氧量 D．实验结果表明一定量的橙子泥需要果胶酶的最适用量为35mL D 26 基因工程的基本工具 考点04 考点04 基因工程的基本工具 考点梳理 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 主要是原核生物 来源 种类 数千种 限制酶不是一种酶，而是一类酶 特点 （1）识别双链DNA分子特定核苷酸序列 （2）断开磷酸二酯键 识别序列长度 一般为4~8个或其他数量的核苷酸，最常见的为6个核苷酸。 专一性 结果 形成黏性末端或平末端 限制酶的命名 EcoRⅠ 属名Escherichia首字母 种名coli 前两个字母 R型菌株 从中分离的第一个限制酶 28 考点04 基因工程的基本工具 考点梳理 二、DNA连接酶——“分子缝合针” 种类 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 作用 差别 只连接____________ 缝合___________和____________ E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 黏性末端 黏性末端 平末端（效率较低） 都能将双链DNA片段“缝合“起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。 29 考点04 基因工程的基本工具 考点梳理 三、基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车” 载体的 作用 载体的必 要条件 载体的种类 ①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 ②具一个或多个限制酶切点，供外源DNA片段（目的基因）插入其中。 ③具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择。 ④必须是安全的 ，对受体细胞无害。 ①作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中 ②在受体细胞内对目的基因进行大量复制 ①细菌的质粒：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 ②病毒：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。 30 考点04 基因工程的基本工具 考点梳理 四、 DNA的粗提取及鉴定 1.破碎细胞—— 称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ， 研磨。 洋葱 研磨液 充分 研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而使研磨液中的DNA含量较低，影响最终提取的DNA量。 2.去除杂质—— 在漏斗中垫上 过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。 纱布 上清液 上清液 不可以用滤纸代替纱布。因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。 3.DNA的粗提取—— 在上清液中加入体积相等的 溶液，静置2~3min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA 。 预冷的酒精 白色丝状物 酒精作用：使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。 预冷的酒精的优点 ①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； ②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出； ③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。 用玻璃棒沿 搅拌，卷起 ，并用滤纸吸去上面的水分：或将溶液倒入塑料离心管中离心，取 晾干。 一个方向 沉淀物 丝状物 为什么要用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌？ 避免破坏DNA 31 实验组 对照组 水浴加热 考点04 基因工程的基本工具 考点梳理 四、 DNA的粗提取及鉴定 4.DNA的鉴定—— 将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入 试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。 二苯胺 2mol/L的NaCl 空白对照组： 在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。 加入2mol/L氯化钠溶液 不加入丝状物 加入4mL二苯胺试剂 加入2mol/L氯化钠溶液 加入丝状物 加入4mL二苯胺试剂 ——看提取物颜色 ——看与二苯胺反应颜色的深浅 DNA纯度 DNA的量 原理一 原理二 原理三 DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精 DNA能溶于物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液 在一定温度下，DNA被二苯胺试剂染成蓝色 32 考点04 基因工程的基本工具 典例精讲 【典例01】某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是（ ） A.①是c；②是b；③是a B.①是a和b；②是a；③是b C.①是a和b；②是b；③是a D.①是c；②是a；③是b A 插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况 ① 能生长 能生长 ② 能生长 不能生长 ③ 不能生长 能生长 解析：第①组：细胞能在含氨共青霉素培养基上生长，说明抗氨芐青霉素基因没有被破坏；细菌能在含四环素培养基上的生长，说明抗四环素基因没有被破坏。由此可知，外源基因插入的位置不是a、6，而是c; 第②组：细胞能在含氨共青霉素培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因没有被破坏；细菌不能在含四环素培养基上的生长，说明抗四环素基因被破坏。说明了外源基因插入位置是b，不是a; 第③组：细胞不能在含氨共青霉素培养基上生长，能在含四环素培养基上的生长，说明抗氨芐青霉素基因被破坏，抗四环素基因没有被破坏，由此可知，外源基因插入的位置是a，而不是b。 综上所述，A正确，BCD错误。 33 考点04 基因工程的基本工具 典例精讲 【典例02】关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（ ） A．粗提取的DNA中可能含有蛋白质 B．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 D 解析：A、低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4°C冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确； B、离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误; C、在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确； D、细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一块儿析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。 34 考点04 基因工程的基本工具 举一反三 【演练01】DNA连接酶是重组DNA技术中常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ） A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D.DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端 C 【演练02】 “DNA粗提取与鉴定”实验需要对材料进行选择、处理。为了提取出DNA相对含量较高的白色丝状物，下列对实验材料的选择和处理，正确的是（ ） A．以猪成熟红细胞为实验材料时，可在滤液中加入适量的木瓜蛋白酶 B．以菜花为实验材料时，在研磨过程中可加入适量的纤维素酶 C．以植物叶片为实验材料时，一般使用体积分数为50%的预冷酒精提取DNA D．以香蕉为实验材料时，将研磨液在4℃的冰箱中放置几分钟后，取沉淀物进行离心 B 35 基因工程的基本操作程序 考点05 考点05 基因工程的基本操作程序 考点梳理 一、目的基因的筛选与获取 （一）目的基因： 主要指的是编码蛋白质的基因 概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 实例：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。 （二）筛选合适目的基因： 筛选方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选 （三）利用PCR获取和扩增目的基因： DNA半保留复制 原理 体外 操作环境 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 目的 可在短时间内大量扩增目的基因 优点 聚合酶链式反应 全称 它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 PCR 37 考点05 基因工程的基本操作程序 考点梳理 一、目的基因的筛选与获取 PCR技术与DNA复制过程比较 比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术 区别 解旋方式 解旋酶催化 DNA在高温下变性解旋 场所 主要在细胞核内 细胞外(主要在PCR扩增仪内) 酶 解旋酶、DNA聚合酶等 热稳定的DNA聚合酶（Taq 酶） 温度 细胞内温和条件 控制温度，需在不同温度下进行 结果 合成整个DNA分子 扩增特定的DNA片段或基因 联系 ①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP） ③酶:均需DNA聚合酶 ④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成 38 考点05 基因工程的基本操作程序 考点梳理 二、基因表达载体的构建 （一）目的： ①让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代; （二）组成： ②使目的基因能够表达和发挥作用。 质粒 ①启动子 基因的前端，RNA聚合酶识别和结合的部位；驱动基因转录出mRNA ②终止子： 限制酶切割位点 基因的尾端，能终止mRNA的转录 ③标记基因 作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来 ④复制原点 ⑤目的基因 目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。 启动子和终止子 之间的部位 （三）构建过程： ①用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口； ②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段 ③利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子。 39 考点05 基因工程的基本操作程序 考点梳理 二、基因表达载体的构建 40 考点05 基因工程的基本操作程序 考点梳理 三、将目的基因导入受体细胞 （1）花粉管通道法（我国科学家独创） 适用生物：开花植物 （2）农杆菌转化法 转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。 1.将目的基因导入植物细胞 2.将目的基因导入动物细胞 （1）常用方法： （2）受体细胞: 显微注射法 受精卵 ①体积大，易操作。②易表现出全能性。 3.将目的基因导入微生物细胞 Ca2+处理法 Ca2+处理目的 可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 受体细胞 （1）原核细胞（常选择大肠杆菌） （2）优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。 41 考点05 基因工程的基本操作程序 考点梳理 四、目的基因的检测与鉴定 目的： 检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性 ①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因 ②检测目的基因是否转录出了mRNA ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 ——“抗原—抗体杂交技术” 2.个体生物学水平鉴定 1.分子水平检测 抗性检测： 功能活性比较： PCR技术或分子杂交技术 抗虫、抗病接种实验； 基因工程产品与天然产品的功能活性比较 ——检测是否具有抗性以及抗性强度等 如：胰岛素注射到糖尿病模型小鼠 42 考点05 基因工程的基本操作程序 考点梳理 五、DNA片段的扩增及电泳鉴定 一、实验原理 （一）DNA体外扩增的原理： ①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。 ②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理； PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 变性 90˚C 延伸 72˚C 退火 50˚C ①DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 ③凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 ②在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。 （二）DNA片段电泳鉴定原理： 43 考点05 基因工程的基本操作程序 考点梳理 五、DNA片段的扩增及电泳鉴定 二、实验步骤 （一）DNA片段扩增的具体过程： 移液：用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。 离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，反应液集中底部 扩增：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 （二）PCR扩增产物电泳鉴定的具体过程： 制备凝胶 电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，质量体积比0.8%～1.2%琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 进行电泳 将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。 接通电源，根据电泳槽距离来设定电压，一般1～5V/cm。待指示剂迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 观察鉴定 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 ①融化： ②倒模: ③凝固: ①加液： ②加样： ③电泳： 44 考点05 基因工程的基本操作程序 典例精讲 【典例01】 DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ） 能连接DNA分子双链碱基对之问的氢键 能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 只能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 T4DNA连接酶既能连接双链DNA片段互补的黏性末端，也能连接平未端 C 解析： A、DNA连接酶连接的是磷酸二醋鍵，A错误; B、DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键，B错误; C、DNA连接酶能连接用不同种限制酶切开的具有相同黏性末端的两条DNA片段，重新形成磷酸二醋键，C错误； D、T4DNA连接酶既能连接双链DNA片段互补的黏性末端，又能连接双链DNA片段的平末端，D正确。 45 考点05 基因工程的基本操作程序 典例精讲 【典例02】在核酸分子杂交技术中,常常使用已知序列的单链核酸片段作为探针(探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段)。为了获得B链作探针,可应用PCR技术进行扩增,应选择的引物种类是(　　) A.引物1与引物2 B.引物3与引物4 C.引物2与引物3 D.引物1与引物4 C 解析：要获得B链，则要获得引物之问的DNA片段，根据PCR中子链延伸方向为5’端到3’端，故需选择引1物2与引1物3进行扩增，ABD错误，C正确。 46 考点05 基因工程的基本操作程序 典例精讲 【典例03】如图为利用生物技术获得生物新品种的过程，有关说法不正确的是（　　） A．a→b过程中一般用4种脱氧核苷酸为原料，并加入两种引物 B．b→c为转基因绵羊的培育过程，常选用的受体细胞是受精卵 C．a→b过程利用了DNA半保留复制的原理，需要使用RNA聚合酶 D．b→d为转基因植物的培育过程，其中④过程常用的方法是农杆菌转化法 C 解析： A、a→b过程是多聚酶链式反应扩增DNA片段的过程，需要加入两种引l物和4种脱氧核苷酸，A正确； B、b→c为转基因绵羊的培育过程，常选用的受体细胞是受精卵（因其全能性最高），B正确； C、b→e过程是多聚酶链式反应扩增DNA片段过程，利用DNA复制原理，需使用耐高温的DNA聚合酶，C错误； D、b→d为转基因植物培育过程，其中⑨过程是将目的基因导入植物细胞，常用方法是农杆菌转化法，D正确。 47 考点05 基因工程的基本操作程序 典例精讲 【典例04】用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是(　　) A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间 B.3号样品为不含目的基因的载体DNA C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰 B 解析： A、PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。3～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250~ 500bp， A不符合题意; B、3号PCR结果包含250~500bp片段，包含目的基因，但导入的目的基因不一定能成功表达，B符合题意; 9号PCR结果不包含250～500bp片段，所以不是所需转基因植株，C不符合题意; D、10号放入蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，D不符合题意。 48 考点05 基因工程的基本操作程序 举一反三 【演练01】如图为某质粒限制酶酶切图谱。某基因不含图中限制酶识别序列，为使该基因与该质粒构建重组质粒，切割目的基因和质粒时应该选择哪两种酶( ) A.NdeⅠ和BamHⅠ B.NdeⅠ和XbaⅠ C.XbaⅠ和BamHⅠ D.EcoRⅠ和KpnⅠ A 【演练02】科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C 导入番木瓜，培育出转基因抗病番木瓜，所用的 Ti 质粒如图所示。下列叙述正确的是（ ） A．该技术的原理是农杆菌的拟核DNA 与番木瓜基因发生重组 B．构建基因表达载体需要限制酶和耐高温的 DNA 聚合酶 C．可利用 PCR 技术筛选出含有抗病毒蛋白基因C 的受体细胞 D．可利用卡那霉素抗性基因检测是否成功构建抗病毒番木瓜 C 49 考点05 基因工程的基本操作程序 举一反三 【演练03】如图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中，与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。以下相关说法不正确的是( ) A.图中Ⅰ是质粒，步骤①需要用到限制酶和DNA连接酶 B.图中Ⅱ是含目的基因的重组质粒，步骤②是将重组质粒导入棉花细胞 C.图中Ⅲ 是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞 D.剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达 B 【演练04】如图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点，下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述，错误的是（ ） A.若通过PCR技术提取该目的基因应　该选用引物甲和引物丙 B.图1中的质粒用BclⅠ切割后，含有　2个游离的磷酸基团 C.构建基因表达载体时为了防止目的　基因和质粒的自身环化，可以选用BamHⅠ和HindⅢ剪切 D.在导入目的基因的受体细胞中，四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因不能同时表达 C 50 基因工程的应用 考点06 考点06 基因工程的应用 考点梳理 一、基因工程在农牧业方面的应用 52 考点06 基因工程的应用 考点梳理 二、基因工程在医药卫生领域的应用 53 考点06 基因工程的应用 考点梳理 三、基因工程在食品工业方面的应用 54 考点06 基因工程的应用 典例精讲 【典例01】科学研究发现的新技术，要变成实际应用，需要很多的实验才能应用到实际中。早在2006年，两个研究小组几乎同时发现，将四个特定基因导入处于高度分化的体细胞(如成纤维细胞等)中，可诱导其形成具有胚胎干细胞样分化潜能的诱导性多能干细胞。虽然至今这项技术还在深入研究，但这项先进技术的潜在应用前景是（ ） A．突破干细胞定向分化的障碍 B．改造和优化人类基因组结构 C．克隆具有优良品质的动物个体 D．解决异体组织/器官排斥难题 D 解析： A、该项技术突破了分化的不可逆性的障碍，使得高度分化的细胞重新具备分裂能力，A错误; B、该项技术只是将四个特定基因导入处于分化终端的体细胞(如成纤维细胞等)中，并没有改造和优化人类基因组结构，B错误； C、这项技术属于转基因技术，不属于克隆技术，C错误; D、可以用病人的体细胞进行此项技术处理，诱导其形成具有胚胎千细胞样分化潜能的诱导性多能千细胞，进而分裂和分化，形成组织、器官，解决异体组织、器官排斥难题，D正确。 55 考点06 基因工程的应用 举一反三 【演练01】如图是将目的基因导入大肠杆菌内制备“基因工程菌”的示意图，其中引物1-4在含有目的基因的DNA上的结合位置如甲图所示，限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ在质粒上的识别位点如乙图所示。以下说法错误的是（　　） A．PCR第一轮循环的产物可作为第二轮反应的模板 B．若已经合成了图甲所示4种引物，应选择引物2和3扩增目的基因 C．过程①中应使用限制酶BamHⅠ切割质粒 D．对于转化失败的大肠杆菌及其培养基应进行灭菌处理，以防其污染环境 B 56 蛋白质工程 考点07 考点07 蛋白质工程 考点梳理 目标 实质 结果 根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。 通过改造或合成基因，来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质。 生产出自然界没有的蛋白质。 设计思路 ①预期的蛋白质功能 ②设计预期的蛋白质结构 ③推测应有的氨基酸序列 ④找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因 ⑤获得所需蛋白质 预期功能 生物功能 设计 推测 改造或合成 行使 折叠 目的基因 转录 mRNA 翻译 多肽链 蛋白质 (三维结构) 思 路 逆中心法则，与天然蛋白质合成的过程相反 58 考点07 蛋白质工程 考点梳理 项目 蛋白质工程 基因工程 操作对象 操作起点 操作水平 操作流程 结果 实质 联系 基因 基因 DNA分子水平 DNA分子水平 预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新基因→获得所需要的蛋白质 目的基因的筛选与获取→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 可生产自然界没有的蛋白质 生产自然界已有的蛋白质 通过改造或合成基因来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质 将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状 ①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程； ②蛋白质工程离不开基因工程，其包含基因工程的基本操作。 预期蛋白质功能 目的基因 59 考点06 基因工程的应用 典例精讲 【典例01】近年来，人工智能(AI)算法在蛋白质工程领域的应用已经被开发，下列关于AI算法在蛋白质工程领域应用的设想中，实现难度最大的是（ ） A．根据人类对蛋白质的功能需求设计蛋白质的高级结构 B．根据蛋白质的空间结构推测其氨基酸序列 C．按照设定的氨基酸序列推测mRNA的碱基序列 D．按照设定的mRNA的碱基序列设计新基因 A 解析：蛋白质工程的过程：根据中心法则逆推以确定目的基因的碱基序列：预期蛋白质功能一，设计预期的蛋白质结构一推测应有氨基酸序列一找到对应的脱氧核苷酸序列(基因）；最终还是回到基因工程上来解决蛋白质的合成。 根据中心法则逆推以确定目的基因的碱基序列：预期蛋白质功能一设计预期的蛋白质结构一推测应有氨基酸序列一找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。其中根据人类对蛋白质的功能需求设计蛋白质的高级结构是最难实现的。A正确，BCD错误。 60 考点06 基因工程的应用 举一反三 【演练01】已知生物体内有一种转运蛋白Y，由300个氨基酸组成。如果将Y中157位的L异亮氨酸变成亮氨酸，261位的酪氨酸变成丝氨酸，改变后的蛋白质Y1不但保留了原有Y的功能，且具备了催化活性。下列说法正确的是（　　） A．蛋白质工程和基因工程的根本区别是操作对象的差异 B．可以通过对Y蛋白基因进行修饰或人工合成获得Y1蛋白基因 C．蛋白质工程操作过程中，不需要酶和载体作为工具 D．细胞内合成Y1蛋白与Y蛋白的过程中，遗传信息的流向是相反的 B 61 谢谢您的观看 THANKS 学霸培优 举一反三 典例精讲 考点梳理 思维导图 $$