精品解析：2024届天津市十二区重点学校高三二模生物试题变式题14-15

1. 科研人员在哺乳动物体内发现了细胞内含有大量线粒体的棕色脂肪组织，其线粒体内膜含有U蛋白，使得H+可以通过U蛋白回流至线粒体基质，降低线粒体内膜两侧H+浓度差，从而减少ATP的合成。图①为持续寒冷刺激引起棕色脂肪组织细胞产热的示意图，图②为持续寒冷刺激引起机体消耗能量相对值变化情况。 根据上述信息，回答以下问题： （1）由图①可知，去甲肾上腺素既是一种___，又是一种___。持续寒冷刺激使棕色组织产热增加的过程中，效应器是传出神经末梢和它支配的___。持续寒冷使去甲肾上腺素分泌增加，该过程的调节方式是___。 （2）棕色脂肪组织细胞被寒冷刺激激活时，线粒体有氧呼吸消耗等量脂肪时，释放的总能量___（增加/减少/不变），但其中热能___。 （3）由图②可知，持续寒冷刺激时，机体维持体温相对稳定所需能量的主要来源发生的变化是：___（填具体细胞）。 （4）根据题干信息可知，U蛋白介导的H+跨膜运输方式是___。 【答案】（1） ①. 神经递质 ②. 激素 ③. 棕色（脂肪）组织细胞和肾上腺 ④. 神经调节 （2） ①. 不变 ②. （所占比例明显）增大 （3）由骨骼肌细胞变为棕色（脂肪）组织细胞 （4）协助扩散 【解析】 【分析】体温调节的过程为：寒冷环境→皮肤冷觉感受器→下丘脑体温调节中枢→产热增加（骨骼肌战栗、立毛肌收缩、甲状腺激素分泌增加），散热减少（毛细血管收缩、汗腺分泌减少）→体温维持相对稳定。炎热环境→皮肤温觉感受器→下丘脑体温调节中枢→增加散热（毛细血管舒张、汗腺分泌增加）→体温维持相对稳定。 【小问1详解】 由图①可知，去甲肾上腺素可以由神经细胞产生也能由肾上腺产生，所以去甲肾上腺素既是一种神经递质，又是一种激素。 持续寒冷刺激使棕色组织产热增加的过程中，效应器是传出神经末梢和它支配的棕色（脂肪）组织细胞和肾上腺。 持续寒冷使去甲肾上腺素分泌增加，该过程的调节方式是神经调节。 【小问2详解】 棕色脂肪组织细胞被寒冷刺激激活时，线粒体有氧呼吸消耗等量脂肪时，由于脂肪消耗量相等，故释放的总能量不变，但是在寒冷条件下，释放的能量中热能所占比例增大，以维持体温稳定。 【小问3详解】 由图②可知，持续寒冷刺激时，骨骼肌产生的能量逐渐减少，棕色脂肪细胞分解脂肪产生的能量逐渐增加，机体维持体温相对稳定所需能量的主要来源发生的变化是：由骨骼肌细胞变为棕色（脂肪）组织细胞。 【小问4详解】 根据“线粒体内膜含有U蛋白，使得H+可以通过U蛋白回流至线粒体基质，降低线粒体内膜两侧H+浓度差”可知，H+是借助U蛋白顺浓度梯度运输，属于协助扩散。 2. 感染流感病毒后，患者常出现发热、咳嗽、头痛、嗓子痛等症状。机体疼痛和发热现象与前列腺素E（PGE）密切相关，部分机制如图所示。回答下列问题： （1）人体感染病毒后，通过炎症反应产生的致痛物质可刺激痛觉感受器，引起细胞膜上的_____，从而产生兴奋。当兴奋传至_____处，人会产生痛觉。 （2）某患者出现持续高烧的症状，体温较长时间维持在38．5℃，在高烧持续期，其机体产热量_____（填“大于”“小于”或“等于”）散热量。服用退烧药后，患者体温降至正常水平。患者机体通过生理性调节增加散热的途径有_____。 （3）流感病毒感染后患者出现发热症状，体温升高，说明机体维持内环境稳态的能力是_____。体温升高时，人体会出现肌肉酸痛，原因是_____。 （4）退烧药布洛芬可以抑制环氧化酶的活性，从而达到镇痛退热的效果，请据图分析布洛芬镇痛退热的机制：布洛芬通过_____，达到镇痛效果；PGE的减少也会使_____中枢的调节作用减弱，使体温恢复正常，达到退热效果。 【答案】（1） ①. （Na+通道打开，）Na+内流 ②. 大脑皮层 （2） ①. 等于 ②. 皮肤毛细血管舒张、汗腺分泌增加等 （3） ①. 有限的 ②. （人体代谢加快，耗氧量增加，由于供氧不足，）肌肉组织无氧呼吸产生乳酸，导致肌肉酸痛 （4） ①. 抑制环氧化酶的活性，减少PGE的产生，降低痛觉感受器对致痛物质的敏感性 ②. 下丘脑体温调节 【解析】 【分析】1、体温稳定时，机体产热量等于散热量；体温上升时，机体产热量大于散热量；体温下降时，机体产热量小于散热量。 2、静息电位是由钾离子外流引起的，膜电位为外正内负；动作电位是由钠离子内流引起的，膜电位为内正外负；痛觉的产生部位是大脑皮层，痛觉产生不属于反射活动。 【小问1详解】 病毒感染后，炎症反应会刺激痛感觉受器，引发细胞膜上的Na+通道开放，钠离子内流，从而产生兴奋；大脑皮层是所有感觉的产生部位，这种兴奋通过神经传导至大脑皮层，人体就会产生痛觉。 【小问2详解】 患者在高烧期间，体温长时间维持在38.5℃，这是因为机体的产热量等于散热量。服用退烧药后，体温降至正常水平；人体会通过生理性调节，如皮肤血管舒张和汗腺分泌增加，来增加散热。 【小问3详解】 流感病毒感染导致体温升高，说明人体维持内环境稳态的能力有限；体温升高时，人体代谢加快，耗氧量增加；由于供氧不足，肌肉组织无氧呼吸产生乳酸，导致肌肉酸痛。 【小问4详解】 据图可知，布洛芬通过抑制环氧化酶的活性减少PGE的产生，降低痛觉感受器对致痛物质的敏感性，达到镇痛效果，同时，PGE的减少也会使下丘脑体温调节中枢的调节作用减弱，使体温恢复正常，达到退热效果。 3. 正常人感染某些细菌或病毒等病原体后会出现发热症状，发热过程分为体温上升期、高温持续期和体温下降期。下图为体温上升期机体体温调节过程的示意图，回答下列问题： （1）据图可知，病原体感染机体并引起机体发热至38．5℃时，使其分泌的甲状腺激素增多，最终使乙细胞产热增多，从而使机体体温上升。另一条途径是通过神经调节直接作用于甲细胞，促进__________，产热增多。同时调节毛细血管，散热减少，体温上升。 （2）图中甲、乙细胞接收的信息分子分别是__________、__________。 （3）某药物X作为常见的退烧药，其作用机理是通过抑制致热性细胞因子的产生，进而起到退烧的效果。在人体退烧过程中，通过生理性调节增加散热的主要方式是毛细血管舒张和__________，因此，服用药物X后的建议是及时补充__________，以维持机体的水盐平衡。 【答案】（1）促进糖原分解，使其代谢增强 （2） ①. 神经递质 ②. 甲状腺激素 （3） ①. 汗液分泌增加（出汗） ②. 淡盐水（或水） 【解析】 【分析】分析题图：激素a为下丘脑分泌的促甲状腺激素释放激素，激素b为垂体分泌的促甲状腺激素，激素c是甲状腺分泌的甲状腺激素。①表示肝糖原分解为葡萄糖，②和④都表示有氧呼吸第一阶段，③和⑤都表示有氧呼吸第二和第三阶段。 【小问1详解】 据题图可知，病原体感染机体并引起机体发热至38．5℃时，下丘脑分泌的激素a促甲状腺激素释放激素和垂体分泌的激素b促甲状腺激素增多。激素b促甲状腺激素通过体液运输作用于靶器官甲状腺，使其分泌的甲状腺激素增多，最终使乙细胞代谢（或有氧呼吸、即图中的④⑤过程）增强，产热增多，从而使机体体温上升；还有一条途径是下丘脑通过神经调节，直接作用于甲细胞肝细胞，促进（肝）糖原分解为葡萄糖（即图中①过程），使其代谢（有氧呼吸，即图中的②③过程）增强，产热增多，导致机体体温上升。 【小问2详解】 题图中甲细胞接受的神经细胞释放的神经递质、乙细胞接收的信息分子是甲状腺细胞分泌的甲状腺激素。 【小问3详解】 在人体退烧过程中，通过生理性调节增加散热的方式是汗腺分泌增加和毛细血管舒张，服用药物X后汗腺分泌增加，出汗导致水分和盐分流失，需补充淡盐水以维持机体的水盐平衡。 4. 研究发现乙醇能引发大鼠的低温反应，其机理可能与乙醇使大鼠的BAT细胞（褐色脂肪细胞）产热降低有关。下图是BAT细胞产热机理和乙醇降低BAT细胞产热的示意图，请据图回答下列问题： （1）寒冷刺激一方面使下丘脑部分传出神经末梢释放________________，该物质被BAT细胞识别后引起细胞中cAMP增加，进而促进脂肪分解参与___________过程；另一方面寒冷刺激还能使下丘脑合成并释放__________________的量增加，最终导致体内甲状腺激素的量增加。 （2）在乙醇的作用下下丘脑释放的5-HT是一种____________（填“兴奋性递质”或“抑制性递质”），通过______方式释放，与其结合的受体位于________（填器官名称）。 （3）分析图示，试说明甲状腺激素促进BAT细胞产热的机理是______________（说出一条途径即可）。 【答案】（1） ①. 去甲肾上腺素 ②. 细胞呼吸##呼吸作用##有氧呼吸 ③. 促甲状腺激素释放激素##TRH （2） ①. 抑制性递质 ②. 胞吐 ③. 垂体 （3）增加去甲肾上腺素受体数量，并促进UCP—1基因的表达，合成的UCP—1蛋白使线粒体产热增多 【解析】 【分析】寒冷刺激使冷觉感受器兴奋，下丘脑体温调节中枢使机体增加产热减少散热以维持体温恒定，下丘脑分泌促甲状腺激素释放激素增加作用于垂体，使垂体分泌促甲状腺激素增加作用于甲状腺，使甲状腺激素分泌增加，甲状腺激素作用几乎于全身每一个细胞，使细胞代谢增强，从而增加产热。 【小问1详解】 据图分析，寒冷刺激一方面使下丘脑部分传出神经末梢释放去甲肾上腺素（神经递质），该过程是神经调节，其结构基础是反射弧，使BAT细胞中cAMP增加，在其作用下，部分脂肪分解，其产物进入线粒体参与细胞呼吸（呼吸作用或有氧呼吸）；另一方面寒冷刺激还能使下丘脑合成并释放促甲状腺激素释放激素的量增加，促进垂体分泌促甲状腺激素，最终导致体内甲状腺激素的量增加，作用于组织细胞，使组织细胞的代谢加快，产生更多的热量。 【小问2详解】 根据题干“研究发现乙醇能引发大鼠的低温反应，其机理可能与乙醇使大鼠的BAT细胞（褐色脂肪细胞）产热降低有关”可推知在乙醇的作用下下丘脑释放的5-HT是一种抑制性递质。神经递质的释放方式为胞吐。据图可知，5-HT作用于垂体，故与5-HT结合的受体位于垂体。　 【小问3详解】 据图可知，甲状腺激素进入BAT细胞后，能增加去甲肾上腺素受体数量，去甲肾上腺素与其受体结合后生成cAMP，cAMP一方面可促进UCP-1基因的表达，另一方面可促进脂肪分解，从而增加产热；同时甲状腺激素能促进UCP-1基因的表达，合成的UCP-1蛋白使线粒体产热增多。 5. BAT（褐色脂肪组织）细胞含有大量线粒体，具有分解脂肪和产热的功能，其数量及代谢异常与肥胖、衰老等现象相关。 （1）图1示有氧呼吸第三阶段，H+通过复合体I、Ⅲ、Ⅳ运至线粒体膜间隙，并顺浓度梯度通过_______（细胞结构）上的ATP合酶，生成大量ATP。 （2）图2为BAT细胞在寒冷刺激下增加产热的机制：产热复合体提高线粒体中Ca2+浓度→促进有氧呼吸第二阶段（三羧酸循环）→提高H+跨膜浓度梯度→_______→________、产热增加。 （3）产热复合体包含E、M和UCP1三种蛋白质。为研究三者的互作情况，构建了三种质粒，分别表达UCPI-HA融合蛋白、E-FLAG融合蛋白、M-FLAG融合蛋白，并获得了转入不同质粒组合的细胞。先利用抗HA抗体偶联磁珠对各组总蛋白进行收集，将收集的蛋白电泳，再分别用抗FLAG抗体与抗HA抗体进行检测，结果如图3。分析图2产热复合体中的A、B分别为______蛋白。 （4）BAT细胞在凋亡过程中会释放肌苷，与相关细胞膜上受体结合发挥作用。用肌苷处理健康BAT和WAT（白色脂肪细胞，主要储存脂肪），发现二者UCPI基因的表达量均显著提高。阐释BAT凋亡时释放肌苷的意义。_____ （5）ENT1是肌苷转运蛋白，在BAT细胞高表达。研究表明，抑制ENT1可以增加胞外肌苷水平，增强细胞产热能力。有人提出可通过抑制ENT1治疗肥胖，从稳态与平衡的角度评价该方案并说明理由。_____ 【答案】（1）线粒体内膜 （2） ①. UCPl将H+运至线粒体基质，减小了膜两侧H+的跨膜浓度梯度 ②. ATP合成比例减少 （3）M、E （4）BAT细胞凋亡时释放肌苷，可促进健康的BAT和WAT细胞UCPl基因表达而增加产热，从而维持机体的体温平衡 （5）有一定的合理性。抑制ENTl可提高胞外肌苷水平，促进BAT和WAT细胞有机物分解，增加产热，达到减重的效果。然而ENTl通过调节胞外肌苷水平，维持体温相对稳定，抑制ENTl可能破坏机体体温平衡的稳态 【解析】 【分析】有氧呼吸主要在线粒体中进行，分为三个阶段。第一阶段在细胞质基质，葡萄糖分解为丙酮酸和少量[H]，产生少量能量；第二阶段在线粒体基质，丙酮酸和水反应生成二氧化碳和大量[H]，产生少量能量；第三阶段在线粒体内膜，O2与[H]结合生成水，产生大量能量。 【小问1详解】 在有氧呼吸第三阶段，从图1能看到，H+经复合体I、Ⅲ、Ⅳ被运到线粒体膜间隙后，会顺着浓度梯度通过线粒体内膜上的ATP合酶。这是因为线粒体内膜是有氧呼吸第三阶段的场所，其上分布着与该阶段反应相关的酶和蛋白质等结构，H+通过这里的ATP合酶完成反应进而生成大量ATP 。 【小问2详解】 从图2的信息来分析，产热复合体使线粒体中Ca2+浓度升高，推动有氧呼吸第二阶段（三羧酸循环）进行，使得H+跨膜浓度梯度增大。之后UCPl发挥作用，将H+运至线粒体基质，这样一来膜两侧H+的浓度梯度就减小了。而ATP的合成与H+的浓度梯度有关，浓度梯度减小，ATP合成比例就会减少，能量更多地以热能形式释放出来，从而产热增加。 【小问3详解】 观察图3，在用抗FLAG抗体与抗HA抗体进行检测后的电泳图中，当转入质粒UCPI-HA和M-FLAG时，磁珠吸附蛋白不能和抗-Flag抗体产生杂交带，即UCPI-HA蛋白和M-FLAG蛋白不能直接结合；当转入质粒UCPI-HA和M-FLAG时，磁珠吸附蛋白能和抗-Flag抗体产生杂交带，即UCPI-HA蛋白和E-FLAG蛋白能直接结合；所以可以推断出产热复合体中的A、B分别为M、E蛋白。 【小问4详解】 题目中明确提到，BAT细胞在凋亡过程中会释放肌苷，并且用肌苷处理健康的BAT和WAT细胞后，二者UCP1基因的表达量均显著提高。UCP1基因表达量提高会增加产热，而机体的体温需要维持在相对稳定的状态，BAT细胞凋亡时释放肌苷，可促进健康的BAT和WAT细胞UCPl基因表达而增加产热，从而维持机体的体温平衡。 【小问5详解】 ENT1作为肌苷转运蛋白在BAT细胞中高表达。从有利方面看，抑制ENT1确实能够增加胞外肌苷水平，而胞外肌苷水平升高可以促进BAT和WAT细胞有机物分解，有机物分解过程中会释放能量，能量一部分用于合成ATP，一部分以热能形式散失，这样就增加了产热，进而有可能达到减重的效果，所以从这个角度讲，通过抑制ENT1治疗肥胖有一定的合理性。但从另一方面看，ENT1在正常情况下通过调节胞外肌苷水平，对维持体温相对稳定起着重要作用。一旦抑制ENT1，这种调节机制被破坏，就可能打破机体体温平衡的稳态，给机体带来不良影响。 6. 磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体的过程如图所示，请回答下列问题。 注：bar为草胺膦抗性基因；Kanr为卡那霉素抗性基因。 （1）无缝克隆时，T5核酸外切酶（从核苷酸链的外侧向内侧剪切核苷酸）沿___（填“5’→3’或“3’→5’”）的方向水解DNA，其目的是形成___。T5核酸外切酶催化的最适温度为37℃，而过程①选择的温度为50℃，目的是___，防止过度水解DNA。 （2）过程②两个片段复性后存在“缺口”的原因是___，过程③所需的酶有___。 （3）与传统的酶切再连法相比无缝克隆技术构建重组质粒的优点有___（多选）。 A. 不受限制酶切位点的限制 B. 不需要使用PCR技术扩增目的基因 C. 不会出现目的基因的反接和自身环化 （4）PCR扩增GFP基因时需依据___的部分核苷酸序列设计引物R2。已知引物F1的碱基序列是5’-TCCGGACTCAGATCTCGAGC-3’，据图分析扩增目的片段的所用的引物R2可对应下表中的___（填序号）。 ① 5’-AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCG-3’ ② 5’-TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGACA-3’ ③ 5’-GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCATAA-3’ （5）利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含有___的培养基上进行筛选和鉴定，将筛选得到的种子种植可得到转基因拟南芥，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中___，了解PA的分布和含量。 【答案】（1） ①. 5'→3' ②. 黏性末端 ③. 降低酶活性 （2） ①. （过程①）形成的黏性末端长度不同 ②. DNA聚合酶和DNA连接酶 （3）AC （4） ①. PABD基因和GFP基因 ②. ③ （5） ①. 草胺膦 ②. 绿色荧光点（的分布） 【解析】 【分析】PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：（1）模板DNA的变性：模板DNA经加热至90℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下一轮反应作准备。（2）模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至50℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。（3）延伸：DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。 【小问1详解】 由图可知，无缝克隆时，过程①中T5核酸外切酶沿5'→3'的方向水解DNA，以形成黏性末端。温度能影响酶活性，T5核酸外切酶催化的最适温度为37℃，而过程①选择的温度为50℃，目的是降低酶活性，防止过度水解DNA。 【小问2详解】 过程②在退火的过程中，两个片段的黏性末端可根据互补序列进行配对结合，但由于过程①形成的黏性末端大于互补配对的区段（同源序列），因此在过程②退火后存在“缺口”。过程③缺口处DNA链的补齐，可以看作DNA分子的复制过程，所需的酶有DNA 聚合酶（DNA聚合酶将游离的单个脱氧核苷酸加到子链3′末端）和DNA连接酶（将两个DNA片段进行连接）。 【小问3详解】 传统的酶切再连法需要用特定的限制酶将目的基因和质粒先进行切割，再用DNA连接酶对目的基因和质粒进行连接，在该过程会形成多个小片段，操作复杂，而无缝克隆技术构建重组质粒是不受限制酶切位点的限制，不会引入多余碱基，不会出现移码突变，不会出现目的基因的反接和自身环化，操作时间短，成功率高，但该过程也需要利用PCR技术扩增，AC正确，B错误。 故选AC。 【小问4详解】 用于PCR扩增的引物是根据一段已知目的基因的核苷酸序列来设计的，由重组DNA图可知，GFP基因和PABD基因进行连接，因此PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，而设计引物F1仅需根据PABD基因一端的核苷酸序列，由于PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列引物R2，即引物R2的一部分能与引物F1进行碱基互补配对，观察表中①②③的引物碱基序列可知，③的5’端部分碱基序列与F1的5’端部分碱基序列互补，因此可知，R2对应于下表中的③。 【小问5详解】 由图可知，bar（草胺膦抗性基因）为标记基因，位于T-DNA上，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含有草胺膦的培养基上进行筛选和鉴定。由题意“将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量”可知，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中绿色荧光点的分布，了解PA的动态变化。 7. 某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP，表达产物能发出绿色荧光）整合到野生型小鼠Gata3基因的一端，该过程未破坏Gata3基因，以此研究小鼠Gata3基因的表达情况，结果如图甲所示。回答下列问题： （1）用图甲中重组的基因构建基因表达载体时，载体可以不需要额外的标记基因，原因是_____。若用质粒构建基因表达载体，则除了图甲中标出的结构，质粒还需要具备的结构有_____（答出2点）。 （2）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的_____，引物的作用是_____。构建重组质粒后，为了确定GFP是否成功整合到质粒中，需要进行PCR检测，若仅用一对引物，则最好选择图甲中的_____。 （3）科研人员实验培育得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，让这两只小鼠交配来获得Gata3—GFP基因纯合的小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，科研人员设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。图中个体_____（填数字）是Gata3—GFP基因纯合的小鼠。 【答案】（1） ①. 图甲中重组基因中含有GFP，能发出绿色荧光 ②. 限制酶切割位点、复制原点 （2） ①. 短单链核苷酸序列 ②. 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 ③. 引物1、引物3 （3）2 【解析】 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【小问1详解】 标记基因可用于对重组质粒进行初步筛选，通常包括抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等，据图可知，图甲中重组基因中含有GFP，能发出绿色荧光，故用图甲中重组的基因构建基因表达载体时，载体可以不需要额外的标记基因；若用质粒构建基因表达载体，则除了图甲中标出的结构，质粒还需要具备的结构有限制酶切割位点（便于进行切割）、复制原点（便于复制）。 【小问2详解】 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸序列，能够使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸；构建重组质粒后，为了确定GFP是否成功整合到质粒中，启动子和终止子之间的片段的序列排序，进行PCR检测，需要选择一对方向相反的引物，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物1和引物3。 【小问3详解】 分析题意，Gata3-GFP融合基因电泳后的DNA片段较大，Gata3基因电泳后的DNA片段较小，用引物1和引物3进行PCR扩增，若小鼠无GFP基因，则无PCR产物，选择引物1和引物2进行扩增，整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以2号个体是Gata3-GFP融合基因纯合子。 8. 为使甘蓝具有抗除草剂能力，科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入甘蓝植株，获得抗草甘膦转基因甘蓝。 （1）基因工程中最核心的步骤是①基因表达载体的构建。步骤②用Ca2+处理农杆菌后获得感受态细胞，以便将重组质粒导入。步骤③将农杆菌与甘蓝愈伤组织共培养后，在步骤④的培养基中添加_________以便筛选出含目的基因的甘蓝植株。 （2）草甘膦抗性基因一条链的两端序列如下，采用PCR技术获取和扩增草甘膦抗性基因，应选用的引物组合为___ A. 5'-CTTGGATGAT-3'和5'-TCTGTTGAAT-3' B. 5'-CTTGGATGAT-3'和5'-TAAGTTGTCT-3' C. 5'-ATTCAACAGA-3'和S'-ATCATCCAAG-3' D. 5'-ATTCAACAGA-3'和5'-GAACCTACTA-3' （3）若目的基因用BamHI和BglⅡ剪切，质粒用BamHI剪切，酶切后的目的基因存在正向与反向两种连接方式。可用BamHI和EcoRI酶对两种重组质粒进行剪切，正向连接的重组质粒会被切去_________kb长度的片段，反向连接的重组质粒会被切去________kb长度的片段。通过凝胶电泳分析产物大小进行区分，如下图所示，图中________（样品1/样品2）为所需基因表达载体。 限制酶 识别序列和切割位点 BamHI —G'GATCC— BglII —A'GATCT— EcoRI —G'AATTC— 【答案】（1） 潮霉素 （2）A （3） ①. 45 ②. 20 ③. 样品2      【解析】 【分析】1、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取，②基因表达载体的构建，③将目的基因导入受体细胞，④目的基因的检测与鉴定； 2、分子水平上的检测： ①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因：DNA分子杂交技术； ②检测目的基因是否转录出了mRNA：分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术。 【小问1详解】 步骤②用Ca2+处理农杆菌获得感受态细胞；T-DNA也称为转移DNA，是Ti质粒上一段DNA，可整合到受体细胞的染色体DNA上，潮霉素抗性基因在T-DNA片段中。在步骤④的培养基中可添加潮霉素以便筛选出含目的基因的甘蓝植株； 【小问2详解】 图l所示碱基序列磷酸端为5′端，羟基端为3′端，在进行PCR操作时，引物应分别基因两条链的3′端根据碱基互补配对原则结合，根据图中两端序列，通常选择5′-CTTGGATGAT-3′（上面链的引物）和5′-TCTGTTGAAT-3′（下面链的引物）作为引物对，A正确、BCD错误。 故选A。 【小问3详解】 据图表可知，BamHI酶切割得到的黏性末端为-GATC，BglII酶切割得到的黏性末端为-GATC，其黏性末端相同，故剪切后的目的基因能与质粒连接在一起；重组质粒形成后，在重组质粒上，不再有BglII酶的识别位点，质粒上的切割位点会有EcoRI酶和BamHI酶，目的基因的编码顺序是从BamHI酶到BglII酶，用EcoRI酶和BamHI酶会将正向连接的目的基因片段剪切去除；正向连接的重组质粒会被切去20+25=45kb长度的片段，反向连接的重组质粒会被切去25kb长度的片段，电泳凝胶中，DNA分子量越大，在凝胶中收到的阻力越大，迁移距离越短，正向连接的重组质粒被切割后两个片段的大小介于反向连接的重组质粒被切割后两个片段的大小之间，说明样品2是所需的基因表达载体。 9. 许多植物病毒运动蛋白可以增加植物胞间连丝的通透性，介导病毒核酸的转移。黄瓜花叶病毒（CMV）是一种寄主范围非常广泛的植物病毒，已有研究表明黄瓜花叶病毒运动蛋白（CMP）介导了病毒核酸分子在植物细胞间的转移。GFP是在水母细胞中表达的一种绿色荧光蛋白。研究人员拟构建CMP-GFP融合基因，并将其转入工程菌中大量合成CMP-GFP融合蛋白，以追踪病毒运动蛋白对植物胞间连丝物质运输中的生理功能。图1表示利用PCR技术获取融合基因的过程。图2表示pUC质粒，Amp²是氨苄青霉素抗性基因；LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶能分解β-半乳糖苷，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色；SmaI、NcoI、EcoRI、Pst1是4种限制酶，它们切割产生的黏性末端均不相同。 （1）构建CMP-GFP融合基因设计引物时，需要把CMP基因的对应终止密码子的3个碱基去掉，原因是___________。质粒上终止子的作用是___________。 （2）若对图1过程中形成的CMP-GFP融合基因进行大量扩增，需要的酶是___________，可以使用的引物是图中的___________。若从以下四个引物中选择其中两个作为引物P2和引物P3的组成部分，应选择___________（填序号）。 ①：5’-CGGGGATCCATACATATGAGTAAA-3’ ②：5’-ACCTTGGAAAGCCATTTTGTATAGTTCATC-3’ ③：5’-ACAGGATCCTATAGATATAG-3’ ④：5’-GATGAACTATACAAAATGGCTTTCCAAGGT-3’ （3）为了使CMP-GFP融合基因能够正确插入pUC质粒中，需要在构建融合基因时在所需引物的___________（填“5’”或“3’”）端添加限制酶____________的序列。将构建成功的重组质粒导入大肠杆菌中，在添加了氨苄青霉素和β-半乳糖苷的培养基中菌落的生长状况和菌落颜色分别是______________。 【答案】（1） ①. 使CMP表达的蛋白质与GFP表达的蛋白质能融合（或使CMP和GFP两个基因能够连续转录和翻译） ②. 使转录停止（或结束） （2） ①. TaqDNA聚合酶（或耐高温的DNA聚合酶） ②. 引物P1和P4 ③. ②④ （3） ①. 5’ ②. NcoI、PstI ③. 能正常生长、白色 【解析】 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【小问1详解】 使CMP表达的蛋白质与GFP表达的蛋白质能融合（或使CMP和GFP两个基因能够连续转录和翻译）构建CMP-GFP融合基因设计引物时，需要把CMP基因的对应终止密码子的3个碱基去掉，否则会分别单独转录和翻译出CMP蛋白和GFP蛋白。终止密码子的作用是使转录停止（或结束）。 【小问2详解】 PCR过程中需要Taq聚合酶（或耐高温的DNA聚合酶），其中引物P1和引物P4可以扩增融合基因，引物P2和引物P3的部分区段是碱基互补配对的，在所给的四个引物中只有②和④是碱基互补配对的。因此应选择②和④作为引物P2和引物P3的组成部分。 【小问3详解】 由于PCR过程中子链延伸的方向从5’端向3’端，因此只能对引物的5’进行修饰，添加限制酶序列，由pUC质粒，可以看出SmaI、NcoI、EcoRI、PstI四种限制切点中SmaI同时位于标记基因中，EcoRI同时位于复制原点中，只有NcoI和PstI既位于启动子和终止子之间，且能够破坏LacZ基因便于后期的筛选，在添加了氨苄青霉素的培养基中由于导入的重组质粒中含有抗氨苄霉素基因，因此能够正常生长，由于LacZ基因被破坏，不能合成β-半乳糖苷酶，不能分解β-半乳糖苷产生蓝色物质，因此菌落应该是呈现白色。 10. 人绒毛膜促性腺激素（hCGβ）是胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，近年研究发现，结肠癌等多种恶性肿瘤细胞的hCGβ基因也有表达，hCGβ与肿瘤的发生、发展及转移有一定关系。研发抗hCGβ疫苗已成为近年来肿瘤生物治疗新的热点，下图为其制备的基本方案。回答下列问题： 注：甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔；AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达；各种限制酶对应的线条所指为其识别序列。 （1）图示hCGβ基因是人工合成的目的基因，在设计引物对其扩增时，为防止目的基因与质粒的自身环化并保证连接的方向性，可在其两端添加___限制酶的识别序列。经实验得知该基因扩增引物长度为10个核苷酸时特异性强、效率高，已知目的基因①处的碱基序列为CCTTTCAGCTCA—，则设计该端对应引物的序列是5＇___-3＇。 （2）图示 hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的是___。从生产控制的角度分析，选用AOX1作为hCGβ基因启动子的优点是___。 （3）阶段Ⅱ大肠杆菌作为受体菌是利用了大肠杆菌___的特点，从而实现重组DNA的扩增，然后在含有___的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进一步进行扩增。 （4）阶段Ⅳ需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养，该培养基不需要添加以下哪些成分___（a.氨苄青霉素b.组氨酸c.无机盐d.琼脂），可在此培养基上生长的酵母菌即为含有hCGβ基因表达载体的目的菌株。将此菌株扩大培养后，离心取上清液，依据___原理进行检测。若上清液中能检测到hCGβ蛋白，则说明hCGβ基因得以表达。 【答案】（1） ①. XhoⅠ、Mum Ⅰ ②. CTCGAGCCTTTCAGCT （2） ①. 有利于hCGβ进入内质网加工 ②. 可以通过控制培养液中甲醇作为唯一碳源，来控制hCGβ基因表达 （3） ①. 繁殖快，易培养、遗传物质少 ②. 氨苄青霉素 （4） ①. a、b ②. 抗原和抗体特异性结合 【解析】 【分析】图中Ⅰ为基因表达载体的构建过程，Ⅱ是将重组DNA导入大肠杆菌，Ⅲ是提取并鉴定所需要的重组质粒，Ⅵ是将选择的重组质粒导入酵母菌内，Ⅴ是筛选符合要求的酵母菌，Ⅵ是提取目的基因的产物。 【小问1详解】 hCGβ基因是人工合成的目的基因，在设计引物对其扩增时，为防止目的基因与质粒的自身环化并保证连接的方向性，可在其两端添加限制酶识别序列，Sma Ⅰ会破坏目的基因，不能添加Sma Ⅰ识别序列；EcoR Ⅰ会破坏质粒上的氨苄青霉素抗性基因（标记基因），不能添加EcoR Ⅰ识别序列；Sal Ⅰ会破坏质粒上的组氨酸合成酶基因，不能添加Sal Ⅰ识别序列；Xho Ⅰ识别序列与Sma Ⅰ识别序列相似，会破坏目的基因，不能添加Sal Ⅰ识别序列。因此，在hCGβ基因两端应添加XhoⅠ、Mum Ⅰ限制酶识别序列。根据转录方向和质粒AOX1启动子位置确定，在①处插入了Xho Ⅰ的识别序列CTCGAG，则①处的碱基序列为5＇-CTCGAGCCTTTCAGCTCA-3＇，互补链中，碱基序列为3＇-GAGCTCGGAAAGTCGAGT -5＇,对其设计引物序列为5＇-CTCGAGCCTTTCAGCTCA-3＇，由于经实验得知该基因扩增引物长度为10个核苷酸时特异性强、效率高，加上Xho Ⅰ的识别序列CTCGAG，总共16个碱基，因此设计该端对应引物的序列是5＇-CTCGAGCCTTTCAGCT-3＇。 【小问2详解】 甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔，因此hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的是有利于hCGβ进入内质网中加工，并分泌到细胞外。AOXⅠ为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达，因此选用AOX1作为hCGβ基因启动子，可以通过控制培养液中甲醇的有无，来控制hCGβ基因的表达hCGβ蛋白的合成。 【小问3详解】 由于线性质粒上含有氨苄青霉素基因，因此导入环化质粒的大肠杆菌具有氨苄青霉素抗性，因此应在含有氨苄青霉素的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进行扩增。 【小问4详解】 由于环状质粒中含有组氨酸合成酶基因和氨苄青霉素抗性基因，且筛选重组质粒时大肠杆菌是在含有氨苄青霉素的培养基上培养的，因此为筛选导入重组质粒的酵母菌，培养基中不需要再加入组氨酸和氨苄青霉素（即a和b），但需要加入无机盐和琼脂，形成固体培养基，以筛选目的菌体。 hCGβ是一种分泌蛋白，可被分泌到细胞外，将培养物离心后分出细胞和培养液两部分，细胞经破碎处理后，再次离心取上清液，可获得较多的hCGβ，用抗hCGβ单克隆抗体分别进行检测，即抗原—抗体杂交法，原理为抗原与抗体特异性结合。若培养液及上清液中均能检测到hCGβ蛋白，则说明hCGβ基因在酵母菌细胞中得到表达，并能分泌到细胞外。 第1页/共1页 学科网（北京）股份有限公司 $ 1. 科研人员在哺乳动物体内发现了细胞内含有大量线粒体的棕色脂肪组织，其线粒体内膜含有U蛋白，使得H+可以通过U蛋白回流至线粒体基质，降低线粒体内膜两侧H+浓度差，从而减少ATP的合成。图①为持续寒冷刺激引起棕色脂肪组织细胞产热的示意图，图②为持续寒冷刺激引起机体消耗能量相对值变化情况。 根据上述信息，回答以下问题： （1）由图①可知，去甲肾上腺素既是一种___，又是一种___。持续寒冷刺激使棕色组织产热增加的过程中，效应器是传出神经末梢和它支配的___。持续寒冷使去甲肾上腺素分泌增加，该过程的调节方式是___。 （2）棕色脂肪组织细胞被寒冷刺激激活时，线粒体有氧呼吸消耗等量脂肪时，释放的总能量___（增加/减少/不变），但其中热能___。 （3）由图②可知，持续寒冷刺激时，机体维持体温相对稳定所需能量的主要来源发生的变化是：___（填具体细胞）。 （4）根据题干信息可知，U蛋白介导的H+跨膜运输方式是___。 2. 感染流感病毒后，患者常出现发热、咳嗽、头痛、嗓子痛等症状。机体疼痛和发热现象与前列腺素E（PGE）密切相关，部分机制如图所示。回答下列问题： （1）人体感染病毒后，通过炎症反应产生的致痛物质可刺激痛觉感受器，引起细胞膜上的_____，从而产生兴奋。当兴奋传至_____处，人会产生痛觉。 （2）某患者出现持续高烧的症状，体温较长时间维持在38．5℃，在高烧持续期，其机体产热量_____（填“大于”“小于”或“等于”）散热量。服用退烧药后，患者体温降至正常水平。患者机体通过生理性调节增加散热的途径有_____。 （3）流感病毒感染后患者出现发热症状，体温升高，说明机体维持内环境稳态的能力是_____。体温升高时，人体会出现肌肉酸痛，原因是_____。 （4）退烧药布洛芬可以抑制环氧化酶的活性，从而达到镇痛退热的效果，请据图分析布洛芬镇痛退热的机制：布洛芬通过_____，达到镇痛效果；PGE的减少也会使_____中枢的调节作用减弱，使体温恢复正常，达到退热效果。 3. 正常人感染某些细菌或病毒等病原体后会出现发热症状，发热过程分为体温上升期、高温持续期和体温下降期。下图为体温上升期机体体温调节过程的示意图，回答下列问题： （1）据图可知，病原体感染机体并引起机体发热至38．5℃时，使其分泌的甲状腺激素增多，最终使乙细胞产热增多，从而使机体体温上升。另一条途径是通过神经调节直接作用于甲细胞，促进__________，产热增多。同时调节毛细血管，散热减少，体温上升。 （2）图中甲、乙细胞接收的信息分子分别是__________、__________。 （3）某药物X作为常见的退烧药，其作用机理是通过抑制致热性细胞因子的产生，进而起到退烧的效果。在人体退烧过程中，通过生理性调节增加散热的主要方式是毛细血管舒张和__________，因此，服用药物X后的建议是及时补充__________，以维持机体的水盐平衡。 4. 研究发现乙醇能引发大鼠的低温反应，其机理可能与乙醇使大鼠的BAT细胞（褐色脂肪细胞）产热降低有关。下图是BAT细胞产热机理和乙醇降低BAT细胞产热的示意图，请据图回答下列问题： （1）寒冷刺激一方面使下丘脑部分传出神经末梢释放________________，该物质被BAT细胞识别后引起细胞中cAMP增加，进而促进脂肪分解参与___________过程；另一方面寒冷刺激还能使下丘脑合成并释放__________________的量增加，最终导致体内甲状腺激素的量增加。 （2）在乙醇的作用下下丘脑释放的5-HT是一种____________（填“兴奋性递质”或“抑制性递质”），通过______方式释放，与其结合的受体位于________（填器官名称）。 （3）分析图示，试说明甲状腺激素促进BAT细胞产热的机理是______________（说出一条途径即可）。 5. BAT（褐色脂肪组织）细胞含有大量线粒体，具有分解脂肪和产热的功能，其数量及代谢异常与肥胖、衰老等现象相关。 （1）图1示有氧呼吸第三阶段，H+通过复合体I、Ⅲ、Ⅳ运至线粒体膜间隙，并顺浓度梯度通过_______（细胞结构）上的ATP合酶，生成大量ATP。 （2）图2为BAT细胞在寒冷刺激下增加产热的机制：产热复合体提高线粒体中Ca2+浓度→促进有氧呼吸第二阶段（三羧酸循环）→提高H+跨膜浓度梯度→_______→________、产热增加。 （3）产热复合体包含E、M和UCP1三种蛋白质。为研究三者的互作情况，构建了三种质粒，分别表达UCPI-HA融合蛋白、E-FLAG融合蛋白、M-FLAG融合蛋白，并获得了转入不同质粒组合的细胞。先利用抗HA抗体偶联磁珠对各组总蛋白进行收集，将收集的蛋白电泳，再分别用抗FLAG抗体与抗HA抗体进行检测，结果如图3。分析图2产热复合体中的A、B分别为______蛋白。 （4）BAT细胞在凋亡过程中会释放肌苷，与相关细胞膜上受体结合发挥作用。用肌苷处理健康BAT和WAT（白色脂肪细胞，主要储存脂肪），发现二者UCPI基因的表达量均显著提高。阐释BAT凋亡时释放肌苷的意义。_____ （5）ENT1是肌苷转运蛋白，在BAT细胞高表达。研究表明，抑制ENT1可以增加胞外肌苷水平，增强细胞产热能力。有人提出可通过抑制ENT1治疗肥胖，从稳态与平衡的角度评价该方案并说明理由。_____ 6. 磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体的过程如图所示，请回答下列问题。 注：bar为草胺膦抗性基因；Kanr为卡那霉素抗性基因。 （1）无缝克隆时，T5核酸外切酶（从核苷酸链的外侧向内侧剪切核苷酸）沿___（填“5’→3’或“3’→5’”）的方向水解DNA，其目的是形成___。T5核酸外切酶催化的最适温度为37℃，而过程①选择的温度为50℃，目的是___，防止过度水解DNA。 （2）过程②两个片段复性后存在“缺口”的原因是___，过程③所需的酶有___。 （3）与传统的酶切再连法相比无缝克隆技术构建重组质粒的优点有___（多选）。 A. 不受限制酶切位点的限制 B. 不需要使用PCR技术扩增目的基因 C. 不会出现目的基因的反接和自身环化 （4）PCR扩增GFP基因时需依据___的部分核苷酸序列设计引物R2。已知引物F1的碱基序列是5’-TCCGGACTCAGATCTCGAGC-3’，据图分析扩增目的片段的所用的引物R2可对应下表中的___（填序号）。 ① 5’-AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCG-3’ ② 5’-TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGACA-3’ ③ 5’-GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCATAA-3’ （5）利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含有___的培养基上进行筛选和鉴定，将筛选得到的种子种植可得到转基因拟南芥，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中___，了解PA的分布和含量。 7. 某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP，表达产物能发出绿色荧光）整合到野生型小鼠Gata3基因的一端，该过程未破坏Gata3基因，以此研究小鼠Gata3基因的表达情况，结果如图甲所示。回答下列问题： （1）用图甲中重组的基因构建基因表达载体时，载体可以不需要额外的标记基因，原因是_____。若用质粒构建基因表达载体，则除了图甲中标出的结构，质粒还需要具备的结构有_____（答出2点）。 （2）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的_____，引物的作用是_____。构建重组质粒后，为了确定GFP是否成功整合到质粒中，需要进行PCR检测，若仅用一对引物，则最好选择图甲中的_____。 （3）科研人员实验培育得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，让这两只小鼠交配来获得Gata3—GFP基因纯合的小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，科研人员设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。图中个体_____（填数字）是Gata3—GFP基因纯合的小鼠。 8. 为使甘蓝具有抗除草剂能力，科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入甘蓝植株，获得抗草甘膦转基因甘蓝。 （1）基因工程中最核心的步骤是①基因表达载体的构建。步骤②用Ca2+处理农杆菌后获得感受态细胞，以便将重组质粒导入。步骤③将农杆菌与甘蓝愈伤组织共培养后，在步骤④的培养基中添加_________以便筛选出含目的基因的甘蓝植株。 （2）草甘膦抗性基因一条链的两端序列如下，采用PCR技术获取和扩增草甘膦抗性基因，应选用的引物组合为___ A. 5'-CTTGGATGAT-3'和5'-TCTGTTGAAT-3' B. 5'-CTTGGATGAT-3'和5'-TAAGTTGTCT-3' C. 5'-ATTCAACAGA-3'和S'-ATCATCCAAG-3' D. 5'-ATTCAACAGA-3'和5'-GAACCTACTA-3' （3）若目的基因用BamHI和BglⅡ剪切，质粒用BamHI剪切，酶切后的目的基因存在正向与反向两种连接方式。可用BamHI和EcoRI酶对两种重组质粒进行剪切，正向连接的重组质粒会被切去_________kb长度的片段，反向连接的重组质粒会被切去________kb长度的片段。通过凝胶电泳分析产物大小进行区分，如下图所示，图中________（样品1/样品2）为所需基因表达载体。 限制酶 识别序列和切割位点 BamHI —G'GATCC— BglII —A'GATCT— EcoRI —G'AATTC— 9. 许多植物病毒运动蛋白可以增加植物胞间连丝的通透性，介导病毒核酸的转移。黄瓜花叶病毒（CMV）是一种寄主范围非常广泛的植物病毒，已有研究表明黄瓜花叶病毒运动蛋白（CMP）介导了病毒核酸分子在植物细胞间的转移。GFP是在水母细胞中表达的一种绿色荧光蛋白。研究人员拟构建CMP-GFP融合基因，并将其转入工程菌中大量合成CMP-GFP融合蛋白，以追踪病毒运动蛋白对植物胞间连丝物质运输中的生理功能。图1表示利用PCR技术获取融合基因的过程。图2表示pUC质粒，Amp²是氨苄青霉素抗性基因；LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶能分解β-半乳糖苷，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色；SmaI、NcoI、EcoRI、Pst1是4种限制酶，它们切割产生的黏性末端均不相同。 （1）构建CMP-GFP融合基因设计引物时，需要把CMP基因的对应终止密码子的3个碱基去掉，原因是___________。质粒上终止子的作用是___________。 （2）若对图1过程中形成的CMP-GFP融合基因进行大量扩增，需要的酶是___________，可以使用的引物是图中的___________。若从以下四个引物中选择其中两个作为引物P2和引物P3的组成部分，应选择___________（填序号）。 ①：5’-CGGGGATCCATACATATGAGTAAA-3’ ②：5’-ACCTTGGAAAGCCATTTTGTATAGTTCATC-3’ ③：5’-ACAGGATCCTATAGATATAG-3’ ④：5’-GATGAACTATACAAAATGGCTTTCCAAGGT-3’ （3）为了使CMP-GFP融合基因能够正确插入pUC质粒中，需要在构建融合基因时在所需引物的___________（填“5’”或“3’”）端添加限制酶____________的序列。将构建成功的重组质粒导入大肠杆菌中，在添加了氨苄青霉素和β-半乳糖苷的培养基中菌落的生长状况和菌落颜色分别是______________。 10. 人绒毛膜促性腺激素（hCGβ）是胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，近年研究发现，结肠癌等多种恶性肿瘤细胞的hCGβ基因也有表达，hCGβ与肿瘤的发生、发展及转移有一定关系。研发抗hCGβ疫苗已成为近年来肿瘤生物治疗新的热点，下图为其制备的基本方案。回答下列问题： 注：甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔；AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达；各种限制酶对应的线条所指为其识别序列。 （1）图示hCGβ基因是人工合成的目的基因，在设计引物对其扩增时，为防止目的基因与质粒的自身环化并保证连接的方向性，可在其两端添加___限制酶的识别序列。经实验得知该基因扩增引物长度为10个核苷酸时特异性强、效率高，已知目的基因①处的碱基序列为CCTTTCAGCTCA—，则设计该端对应引物的序列是5＇___-3＇。 （2）图示 hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的是___。从生产控制的角度分析，选用AOX1作为hCGβ基因启动子的优点是___。 （3）阶段Ⅱ大肠杆菌作为受体菌是利用了大肠杆菌___的特点，从而实现重组DNA的扩增，然后在含有___的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进一步进行扩增。 （4）阶段Ⅳ需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养，该培养基不需要添加以下哪些成分___（a.氨苄青霉素b.组氨酸c.无机盐d.琼脂），可在此培养基上生长的酵母菌即为含有hCGβ基因表达载体的目的菌株。将此菌株扩大培养后，离心取上清液，依据___原理进行检测。若上清液中能检测到hCGβ蛋白，则说明hCGβ基因得以表达。 第1页/共1页 学科网（北京）股份有限公司 $