3.1 重组DNA技术的基本工具课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

第1节 重组DNA技术的基本工具 第3章 基因工程 怎么能让大肠杆菌产生胰岛素呢？ 不同生物在信息传递过程中都遵循中心法则，并共用同一套遗传密码。 1970 史密斯 感受态流感嗜血杆菌 放射性标记的沙门氏噬菌体的DNA 共同孵化 检测噬菌体DNA是否转化进入细菌细胞内 并未检测到放射性标记的噬菌体DNA 噬菌体DNA为什么检测不到了？ 1970 史密斯 感受态流感嗜血杆菌 放射性标记的沙门氏噬菌体的DNA 共同孵化 检测噬菌体DNA是否转化进入细菌细胞内 并未检测到放射性标记的噬菌体DNA 噬菌体DNA可能被流感嗜血杆菌降解了 实验一 实验二 噬菌体DNA溶液黏度下降; 细菌自身DNA溶液黏度无变化 (DNA长度越长，溶液黏度越高) 流感嗜血杆菌中可能存在什么物质？ 5 1970 史密斯 感受态流感嗜血杆菌 放射性标记的沙门氏噬菌体的DNA 共同孵化 检测噬菌体DNA是否转化进入细菌细胞内 并未检测到放射性标记的噬菌体DNA 噬菌体DNA可能被流感嗜血杆菌降解了 实验一 实验二 噬菌体DNA溶液黏度下降; 细菌自身DNA溶液黏度无变化 (DNA长度越长，溶液黏度越高) 流感嗜血杆菌可能有切断噬菌体DNA的酶 6 任务１： 根据信封Ａ中EcoR1切割DNA分子产生的片段，推测该酶的识别序列及切割位点，并将其填写在活动单上。(请用箭头标出切割位点) EcoR1 EcoR1 识别序列 回文结构 切割位点 切割位点 识别双链DNA中特定核苷酸序列 在每条单链特定的部位断开磷酸二酯键 磷酸二酯键 限制性内切核酸酶（限制酶） EcoR1 限制性内切核酸酶（限制酶） —分子手术刀 黏性末端 根据信封B中限制性内切核酸酶切割DNA分子产生的片段，推测这些序列是由几种限制性内切核酸酶切割?请将这些酶的识别序列及切割位点填写在学习单上(请用前头标出切割位点)。 任务２： EcoRⅠ 属名Escherichia首字母 种名coli前两个字母 R型菌株 从中分离的第一个限制酶 限制性内切核酸酶名字的由来： 博耶 11 平末端 尝试用剪刀模拟EcoR1切割DNA（信封C），获得目的基因（人胰岛素基因） 任务3 需要将目的基因送入细胞的载体 ——“分子运输车” 胰岛素基因 （目的基因） 质粒 独立于拟核外的，小型环状DNA分子。 有复制原点，能自我复制 复制原点 任务4 尝试选择合适的质粒（信封D），将目的基因与所选择的质粒拼接成重组DNA分子。 讨论： 你选择质粒的原因是什么？ 只以氢键相连的两个末端是不 是稳定的，如何使重组DNA结构稳定？ 目的基因 质粒 重组 DNA分子 质粒1 质粒2 “分子运输车” ——载体 有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（目的基因）插入其中。 具有复制原点，能使目的基因随之复制。 有特殊的标记基因，便于重组DNA的筛选。 1970年 第一个限制酶被发现 1972年 构建重组DNA分子 复制原点 “分子手术刀” 准确切割DNA分子 “分子缝合针” “分子运输车” 将DNA片段连接起来 将体外重组好的DNA分子导入受体细胞 重组DNA技术所需的三种基本工具： 01 限制性内切核酸酶 — “分子手术刀” 一、限制性内切核酸酶 ——“分子手术刀” 1.来源： 主要是原核生物 简称限制酶 2.种类： 数千种 注意：限制酶不是一种酶，而是一类酶。 一、限制性内切核酸酶 ——“分子手术刀” 1.来源： 主要是原核生物 简称限制酶 2.种类： 数千种 注意：限制酶不是一种酶，而是一类酶。 3.功能： 能够识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 为什么限制酶不切割原核生物本身的DNA分子？ 原核细胞DNA中不存在限制酶的识别序列或能被识别的序列被修饰了。限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、起防御作用。 特点：专一性 “两个特定” 4.识别序列： 一、限制性内切核酸酶 ——“分子手术刀” 大多数限制酶的识别序列由___个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由___个、___个或 的核苷酸组成。 6 4 8 其他数量 识别的序列的特点 ①均有一条中心轴线。 ②中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列，即：一条链正向读与另一条链反向读的碱基顺序完全一致。 注意：限制酶识别过程具有方向性 都是从5’→3’开始读 从5’→3’正向读与另一条链从5’→3’反向读的碱基顺序完全一致 一、限制性内切核酸酶 ——“分子手术刀” 6.作用结果： 产生黏性末端、平末端 EcoR Ⅰ (在G与A之间切割) 中轴线 黏性末端 平末端 Sam Ⅰ (在G与C之间切割) 黏性末端 黏性末端 识别序列： GAATTC 切割部位： GA之间的磷酸二酯键 形成黏性末端（从5’往3’读）： AATT ①形成 个相同（互补）的黏性末端 可断开 个磷酸二酯键 消耗 分子水 2 2 ②形成___个游离的磷酸基团 2 ③产生___个切口 1 2 黏性末端： 限制酶在它识别序列的中心轴线两侧，将DNA分子的两条链分别切开时，切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口是黏性末端。 平末端： 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。 例：SmaⅠ只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。 可断开 个磷酸二酯键 ①形成 个相同平末端 消耗 分子水 ②形成___个游离的磷酸基团 2 2 2 2 ③产生___个切口 1 平末端 C G C C G G G C G C G C 5' 3' 3' 5' C G C C G G G C G C G C BamHⅠ ； EcoRⅠ ；Hind Ⅲ ；BglⅡ 。 【练习】：写出下列限制酶切割形成的黏性末端 GATC AATT AGCT GATC 思考：同种限制酶切割的黏性末端一定相同吗？不同种限制酶切出的黏性末端一定不同吗？ 同种限制酶切割产生的黏性末端相同，不同限制酶可能会形成相同的黏性末端 例：限制性EcoRI的识别序列和切点是－G↓AATCC－，补充完整切割过程图： 限制性SmaI的识别序列和切点是－GGG↓CCC－，补充完整切割过程图： —G —CTTAA AATTC— G— —GAATTC— —CTTAAG— EcoRI —GGG —CCC CCC— GGG— —GGGCCC— —CCCGGG— Sma I 黏性末端 平末端 两种末端的正确书写 二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 【思考】请判断：以下黏性末端是由______种限制酶作用产生的。 3 做题技巧：注意观察识别序列和切割位点 ①找到切割位点 ②补全序列 练习 下图所示的黏性末端属于同一种限制酶切割产生的是（ ） C A①② B①③ C②④ D③④ 1.要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？ 可产生几个黏性末端？ 要切两个切口，产生四个黏性末端。 2.如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？ 会产生相同的黏性末端 3.限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？ 不能。限制酶只能识别并切开双链DNA分子。 二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 思考: 4.推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？ 原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。 限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。 所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。 二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 5.为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？ 通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。 思考: 1、下图表示限制酶切割某DNA的过程，从图中可知，该限制酶识别的碱基序列，及切割位点是 A.5'-CTTAAG-3'，切点在C和T之间 B.5'-CTTAAG-3'，切点在G和A之间 C.5'-GAATTC-3'，切点在G和A之间 D.5'-CTTAAC-3'，切点在C和T之间 C 练习 2、下面哪项不具有限制酶识别序列的特征 A.GAATTC B.GGGGCCCC CTTAAG CCCCGGGG C.CTGCAG D.CTAAATC GACGTC GATTTAG D 3.在DNA 测序工作中，需要将某些限制性内切酶的限制位点在 DNA上定位，使其成为 DNA 分子中的物理参照点。这项工作叫做“限制酶图谱的构建”。假设有以下一项实验：用限制酶 HindⅢ，BamHⅠ和二者的混合物分别降解一个 4kb（1kb即1千个碱基对）大小的线性DNA 分子，降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，如下图所示。据此分析，这两种限制性内切酶在该DNA 分子上的限制位点数目是以下哪一组？ A.HindⅢ1个，BamHⅠ2 个 B.HindⅢ2个，BamHⅠ3个 C.HindⅢ2个，BamHⅠ1 个 D.HindⅢ和BamHⅠ各有2 个 A 练习 02 DNA连接酶 — “分子缝合针” C G G C C G T A T A A T A T G C G C G C T A A T C G T A T A A T A T G C T A T A EcoR I EcoR I C G G C C G T T A A A A T T G C G C G C T A A T C G T T A A A A T T G C T A T A C G G C C G T T A A A A T T G C T A T A 生物A基因片段 生物B基因片段 将不同种来源的DNA片段连接起来 不同来源的DNA片段混合 三、DNA连接酶——“分子缝合针” 1.作用： 将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 注意：不是连接氢键 （氢键的形成不需要酶的催化） 2.种类： 类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 功能 只缝合____________ 缝合____________和____________ 结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________ 大肠杆菌 T4噬菌体 黏性末端 黏性末端 平末端 磷酸二酯键 三、DNA连接酶——“分子缝合针” 可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来， （1）E·coli DNA连接酶或T4DNA连接酶连接黏性末端 即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 三、DNA连接酶——“分子缝合针” （2）T4 DNA连接酶连接平末端，效率低 三、DNA连接酶——“分子缝合针” G A G T A T C DNA 连接酶 DNA 连接酶 A T A G T C C G A A T T DNA连接酶：连接两个DNA片段 C A A T T DNA 聚合酶 DNA聚合酶：以DNA的一条链作为模板，连接游离的脱氧核苷酸，形成磷酸二酯键。 思考：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？ DNA连接酶、限制酶、 DNA聚合酶、解旋酶、DNA酶的比较 项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶 DNA酶 作用部位 作用对象 作用结果 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键 DNA片段 DNA 单个的脱氧 核苷酸 DNA DNA 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割双链DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链 三、DNA连接酶——“分子缝合针” ①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶 b a A. 切断a处的酶为_______ B. 连接a处的酶为_______ C. 切断b处的酶为_______ ① ③④ ② a：磷酸二酯键；b：氢键 练一练：根据所学知识，完成以下填空 你能用DNA连接酶将他们连接起来吗？ 2和 3和 ； 1和 ； 4和 。 7 6 5 8 旋转180度 判断两个末端是否为同一种限制酶切割产生的方法：将其中一个末端旋转180度，若与另一个完全相同，则说明两个末端可能是用同一种限制酶切割 三、DNA连接酶——“分子缝合针” 4、限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是 A.DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键 B.限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸 C.E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端 D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以原核生物中的限制酶也能剪切自身的DNA 练习 B 5、下列有关基因工程中限制酶的描述，正确的是 A.同种限制酶既可以切割目的基因又可以切割质粒，因此不具备专一性 B.限制酶只能识别和切割DNA，不能识别RNA C.限制酶与DNA连接酶的作用部位不相同 D.限制酶只能从原核生物中提取 B 一种限制酶能识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并在特定位点上切割DNA分子，既可以切割目的基因又可以切割质粒，体现了酶的专一性，A错误；限制酶与DNA连接酶的作用部位相同，都是磷酸二酯键，C错误；限制酶主要从原核生物中提取，D错误。 6、如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性内切核酸酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是 A.①②③④ B.①②④③ C.①④②③ D.①④③② C 练习 C A.甲、乙、丙黏性末端分别是由不同的限制酶切割产生的 B.甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重组DNA分子，但甲、丙不能 C.DNA连接酶的作用位点是b处 D.切割产生甲的限制酶不能识别由甲、乙黏性末端形成的重组DNA分子片段 7、下列有关如图所示的黏性末端的说法，错误的是 练习 03 基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车” 1.载体的作用是什么？ 2.有哪些种类？ 3.常用的载体是哪种？其有什么特征？ 4.作为载体应具备什么条件？ 三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 作为运载工具，将外源基因送入受体细胞 质粒、噬菌体和动植物病毒 质粒 将 送入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 外源基因 在基因工程中使用的载体包括 等。 质粒、噬菌体和动植物病毒 三、基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车” 1.作用： 2.种类： 3.最常用的载体——质粒 一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 终止子：转录的终点，在转录过程中起调控作用。 启动子: 转录的起点，在转录过程中起调控作用。 复制原点:DNA复制的起始位点。 标记基因 其基因属于细胞质基因。 四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 4.运载体需具备的条件： ①在受体细胞中稳定存在并能自我复制 或整合到受体DNA上，随受体DNA同 步复制； ②有一个至多个限制酶切割位点， 便于插入（携带）目的基因； ③具有标记基因，便于筛选含有重组DNA分子的细胞； ④对受体细胞无害、易分离。 真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 知识拓展 标记基因通常有: ①抗生素的抗性基因，如: 抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr) ②荧光蛋白基因，如: 绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP) 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体携带目的基因导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。 目的基因是一个DNA片段，不含有复制原点、不含有启动子和终止子。 3.为什么不能直接将目的基因导入受体细胞？？ 1.质粒上有一个或多个限制酶切点，有什么作用？ 思考： 大肠杆菌及质粒结构模式图 供外源基因或外源DNA片段插入其中。 2.质粒上有标记基因，有什么作用？ 便于重组DNA的筛选、鉴定和选择。 目的基因不能自主复制，不能稳定存在并遗传给后代。 四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 限制酶的选择 1.酶切位点要保证目的基因是完整的 2.酶切位点要要位于启动子和终止子之间（启动子下游） 11、用限制酶EcoRⅤ单独切割某质粒，可产生1个14 kb(1 kb即1 000个碱 基对)的长链，而同时用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ联合切割该质粒，可得到 三种长度的DNA片段，见下图(其中*表示EcoR Ⅴ切割后的一个黏性末端)。 若用MboⅠ单独切割该质粒，则产生的DNA片段的长度为 A.2.5 kb和5.5 kb B.2.5 kb和6 kb C.5.5 kb和8 kb D.6 kb和8 kb D 练习 解析　用限制酶EcoR Ⅴ单独切割该质粒，可产生1个14 kb(1 kb即1 000个碱基对)的长链，说明该质粒中含有1个EcoRⅤ切割位点；同时用限制酶EcoRⅤ、Mbo Ⅰ联合切割该质粒，可得到三种长度的DNA片段，说明该质粒中含有2个MboⅠ切割位点。但确定MboⅠ的酶切位点时要注意*表示的是EcoRⅤ切割后的黏性末端，则用MboⅠ单独切割该质粒，则产生的DNA片段的长度为6 kb和8(即2.5＋5.5)kb，D正确。 54 限制酶 DNA连接酶 载体 ①对受体细胞无害； ②有一个至多个限制酶切割位点； ③有特殊的标记基因； ④能自我复制或能整合到宿主DNA上。 质粒、噬菌体 、动植物病毒 基因工程的基本工具 作为载体的条件 种类： 磷酸二酯键 来源 ： 主要来源于原核生物 特点： 作用部位： 具有专一性 结果： 形成黏性末端或平末端 连接部位：磷酸二酯键 种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶 作用： 把两条双链DNA片段拼接起来 课堂小结 提取生物大分子的基本思路： 选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。 五、DNA的粗提取与鉴定 1.实验原理 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 DNA不溶于酒精， 但某些蛋白质溶于酒精 DNA能溶于物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液 在一定温度下， DNA被二苯胺试剂染成蓝色 初步分离DNA和蛋白质 溶解DNA 鉴定DNA 五、DNA的粗提取与鉴定 $$