3.2基因工程操作步骤（第2课时）课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

3.2基因工程的基本操作程序 苏云金杆菌 与载体拼接 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞 抗虫棉 提取 表达Bt基因 导入 Bt基因 重组DNA分子 培育转基因抗虫棉的简要过程 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的 检测与鉴定 培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？ 目录 CONTENTS 第二步：基因表达载体的构建 2/ 第一步：目的基因的筛选与获取 1/ 第三步：将目的基因导入受体细胞 3/ 第四步：目的基因的检测与鉴定 4/ DNA 片段的扩增及电泳鉴定 5/ 与RNA聚合酶结合位点 RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA 启动子 终止子 本质： 位置： 作用： 是一段有特殊序列结构的DNA片段； 位于编码区上游； 也是一段有特殊序列结构的DNA片段； 位于编码区下游； 终止转录 本质： 位置： 作用： 原核细胞的基因结构 启动子 终止子 非编码区 非编码区 编码区 能编码特定的蛋白质 编码区上游 编码区下游 真核生物基因的表达 知识拓展：基因的结构 真核生物的DNA转录形成的mRNA需要在细胞核加工处理成为成熟的mRNA后才能作为下一步翻译的模板。 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 位置 功能 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的比较 DNA片段 DNA片段 mRNA上三个相邻的碱基 mRNA上三个相邻的碱基 编码区上游 编码区下游 mRNA首端 mRNA尾端 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号（编码氨基酸） 翻译的结束信号（不编码氨基酸） 二、基因表达载体的构建 1.目的： ①让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代; 2.组成： 质粒 ①启动子 基因的前端，RNA聚合酶识别和结合的部位；驱动基因转录出mRNA ②终止子： 限制酶切割位点 基因的尾端，能终止mRNA的转录 ③标记基因 作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来 ④复制原点 ⑤目的基因 ②使目的基因能够表达和发挥作用 目的基因该插入什么位置？ 基因工程的核心 目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。 启动子和终止子之间的部位 诱导型启动子 诱导物 作用 激活或抑制 目的基因表达 诱导型启动子： 2.组成： 基因工程的核心 二、基因表达载体的构建 诱导型启动子 诱导物 作用 目的基因表达 激活或抑制 诱导型启动子：有时为了满足需要，在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。 启动子控制 RNA 聚合酶和转录因子的结合。由于启动子区域驱动目标基因的转录，因此它决定了基因表达的时间，并在很大程度上决定了将产生的重组蛋白的数量。许多常见的推动者。像 CMV、EF1A 和 SV40 启动子一样，总是活跃的，因此被称为组成型（constitutive ）启动子。其他的仅在特定情况下才活跃。在这篇文章中，我们将讨论可诱导 启动子，它可以从OFF状态切换到ON状态，以及如何在研究中使用这些启动子。 诱导型启动子可以通过阳性或阴性对照进行调节。 1.1 阳性诱导 在关闭状态下，启动子没有活性，因为激活蛋白不能结合。在诱导物与激活蛋白结合后，激活蛋白可以与启动子结合，将其打开并启动转录。 1.2 阴性诱导 在关闭状态下，启动子是无活性的，因为结合的阻遏蛋白会主动阻止转录。一旦诱导物与阻遏蛋白结合，阻遏蛋白就会从 DNA 中去除。当阻遏蛋白不存在时，转录开启。 1个切口 质粒（载体） DNA分子（含目的基因） 获得目的基因，带有 两个黏性末端 （/平末端） DNA 连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 同种 限制酶 （或产生相同末端的限制酶） 3.构建过程： 【问题探究】请结合下图，回答问题： （1）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？ 不能 因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。 载体 目的基因 自连 片段间的连接 目的基因自连 质粒自连 目的基因与质粒连接 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 正向连接 反向连接 1 1’ 2 2’ 1 2 2’ 1’ 2 2’ 1’ 1 活动一：用同一种限制酶切割目的基因和质粒，用DNA连接酶连接后得到哪些分子？ 1.载体的自身环化和目的基因的自身环化 2.目的基因和载体反向连接 弊端 质粒与目的基因反向连接 终止子 启动子 （3）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？ ①可以防止质粒、目的基因的自身环化连接； ②还可以防止目的基因与载体的反向连接。 【问题探究】 双酶切 （产生不同的粘性末端） 用两种不同的限制酶同时对目的基因和载体进行切割 【实战】图解限制酶的选择 （1）不破坏目的基因： 如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SamⅠ。 （2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点： 所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 （3）确保表达载体和目的基因出现相同黏性末端： 通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ； （4）为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，可选用什么限制酶？ 可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒。 （1）原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入到某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入到四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。 延伸：筛选 含目的基因/空质粒的两种受体细胞 （3）筛选方法： ①将转化后的细菌放在含氨苄青霉素培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌、含空质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落； ②再利用灭菌的绒布影印到含四环素培养基上，不生长的即为含目的基因的菌落，如图1、5。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 延伸：筛选含目的基因的受体细胞（以大肠杆菌为例） $$