3.2基因工程操作步骤（第1课时）课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

3.2基因工程的基本操作程序 苏云金杆菌 与载体拼接 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞 抗虫棉 提取 表达Bt基因 导入 Bt基因 重组DNA分子 培育转基因抗虫棉的简要过程 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的 检测与鉴定 培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？ 目录 CONTENTS 第二步：基因表达载体的构建 2/ 第一步：目的基因的筛选与获取 1/ 第三步：将目的基因导入受体细胞 3/ 第四步：目的基因的检测与鉴定 4/ DNA 片段的扩增及电泳鉴定 5/ 01 目的基因的筛选与获取 一、目的基因 1.概念 2.类型 3.实例 资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。 培育转基因抗虫棉用到的目的基因 Bt 抗虫蛋白基因 简称 Bt 基因 【相关信息】P77 ①Bt抗虫蛋白的抗虫原理？ ②抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？ 01 目的基因的筛选与获取 二、筛选合适的目的基因 1.较为有效的方法之一 从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。 测序技术 序列数据库 序列比对工具 利用测序技术、序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因 DNA测序仪 核苷酸序列比对 氨基酸序列比对 测定核酸和蛋白质序列 以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库 把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。 三、获取目的基因的方法 1.人工合成目的基因。 2.通过构建基因文库来获取目的基因。 3.常用 PCR 特异性地快速扩增目的基因。 01 目的基因的筛选与获取 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 DNA合成仪 PCR是_______________的缩写，是一项根据___________ ________的原理，在____提供参与DNA复制的_______与_________，对____________________进行________的技术； （1）概念 聚合酶链式反应 DNA半保 体外 各种组分 反应条件 目的基因的核苷酸序列 大量复制 全称 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外（PCR扩增仪/PCR仪） 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 可以在短时间内大量扩增目的基因 一.目的基因的筛选与获取 4.利用PCR获取和扩增目的基因 留复制 原理 操作环境 目的 优点： PCR扩增仪 问题:结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？ 要点回顾:体内DNA复制 模板： 原料： 能量： 酶： DNA的两条母链 4种游离的脱氧核苷酸 解旋酶、DNA聚合酶 复制特点: ①边解旋边复制 ②半保留复制 碱基互补配对原则 （保证复制的准确进行） 条件 复制原则: 子链的延伸方向： 5'端→3'端 因为 DNA聚合酶只能从5'端向3'端延伸子链。 一.目的基因的筛选与获取 ATP 耐高温的DNA聚合酶 （Taq酶） DNA模板 引物 缓冲溶液 （一般添加Mg2+） （2）PCR条件: 一.目的基因的筛选与获取 4.利用PCR获取和扩增目的基因 四种脱氧核苷三磷酸 激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶 （2种） 提供相应稳定的pH环境与某些离子； 实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 (dNTP) 要有一段已知目的基因的核苷酸序列 PCR不用解旋酶，用高温代替 dATP与ATP在结构上有什么区别？dATP为什么能用作DNA复制的底物？ 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 3’ 5’ 引物1 3’ 5’ 引物2 什么是引物？ 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 引物可以是DNA单链， 也可以为RNA单链， 细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物 细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物 用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。 引物结合在模板链的3’端 01 目的基因的筛选与获取 （DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能） 1）变性（不需要解旋酶）： 当温度上升到_______以上时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。 氢键 单链DNA 待扩增的DNA片段 第一步：变性 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 变性 90℃ PCR反应的过程 01 目的基因的筛选与获取 2）复性： 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过 与两条单链DNA结合。 第二步：复性 引物1 引物2 DNA引物 3’ 5’ 3’ 5’ 碱基互补配对 5’ 5’ 思考：为什么需要引物？引物结合在模板链的什么位置？ ①因为Taq酶不能从0开始添加核苷酸。 ②引物结合在DNA模板链 3'端位置，引导子链从 5'端→3'端方向复制。 3’ 3’ PCR反应的过程 01 目的基因的筛选与获取 3）延伸： 当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的____________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 第三步：延伸 引物1 引物2 Taq酶 Taq酶 3’ 5’ 3’ 5’ 脱氧核苷酸 5’ 5’ DNA聚合酶 72℃ 3’ 3’ 3’ 3’ 思考1：为什么温度要上升至72℃？ 思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？ 72℃是Taq酶(耐高温的DNA聚合酶)的最适温度 Taq酶结合在引物的3’端 PCR反应的过程 01 目的基因的筛选与获取 PCR反应的过程、产物 第一轮循环的产物 第二轮循环的产物 第三轮的产物 由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。 即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。 01 目的基因的筛选与获取 （1）要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？ 要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。 （2）如果循环n次，则共需消耗 个引物。 则共需消耗 对引物。 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 3’ 5’ 引物1 3’ 5’ 引物2 【问题探究1】 （3）PCR过程中需要加入两种引物，原因是？ DNA是反向平行的双链，DNA聚合酶只能从引物3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增。 （2）如果循环n次，则共需消耗 个引物。 则共需消耗 对引物。 2n－1 2n+1－2 （4）两种引物都结合在DNA模板链的 端； 脱氧核苷酸连接在引物的 端进行延伸。 3’ 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 3’ 5’ 引物1 3’ 5’ 引物2 （5）设计引物的依据是？ 已知目的基因两端（3’端）的部分核苷酸序列，以便根据该序列合成引物。 3’ 思考下列设计的引物失败的原因？ ①引物自身不能环化 ②两种引物之间不能互补配对 ③引物长度不宜过短，防止引物随机结合 【例1】设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。 第1组： ； 第2组： 。 引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效 (1)在PCR技术扩增目的基因时 （需要/不需要）解旋酶，原因是 。 (2)利用PCR技术扩增目的基因前，需根据目的基因的核苷酸序列设计 种引物，进行PCR时需加热至90∽95度然后冷却至55∽60度，此操作的目的是 。 【练习】如图为PCR技术扩增图解，请回答下列问题 不需要 PCR过程中是通过高温使DNA双链解聚为单链的，而不是用解旋酶 两 ①90∽95度高温使DNA解聚为单链， ②然后冷却至55∽60度使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 (3)PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的__________和_________，前者由________ 自动调控，后者则靠___________来维持。 （4）从理论上讲，在PCR技术中，循环4次产生的DNA分子中，第四次循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为 。 （5）假设DNA片段有150个脱氧核苷酸对，若DNA分子中胞嘧啶脱氧核苷酸有70个，则5次循环，需要胸腺嘧啶脱氧核苷酸 个（不考虑引物所对应的片段） （6）假设DNA片段有200个脱氧核苷酸对，经3次扩增后，从理论上计算，除需要引物 个外（注：每个引物中含有20个脱氧核苷酸），还需要游离的脱氧核苷酸 个。 温度 PH值 PCR扩增仪 缓冲液 15/16 2480 2520 (2n-1)T (2n-1)400 - 20×14 (2n+1-2)=14 14 DNA复制 PCR技术 场所 遵循原则 条件 解旋方式 酶 特点 结果 PCR技术 vs DNA复制 碱基互补配对原则 碱基互补配对原则 模板、4种脱氧核苷酸、酶、能量、引物 模板、4种脱氧核苷酸、酶、能量、引物(2种） DNA在高温下热变性解旋 解旋酶催化 半保留复制、边解旋边复制 半保留复制、全解旋再复制 体外复制 细胞内（主要在细胞核内） 大量的DNA片段 形成整个DNA分子 耐高温的DNA聚合酶 解旋酶、DNA聚合酶等 DNA连接酶 5’ 3’ 5’ 5’ 第一次循环 第二次循环 3’ 5’ 第三次循环 3’ 3’ 【拓展思维】 PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？ 用PCR可以扩增mRNA吗？ mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。 1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交双链； 2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA； 3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子 24 $$