第3章基因工程知识清单-2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第三章 基因工程 第1节　重组DNA技术的基本工具 一、基因工程的概念 概念：是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，将外源 目的基因 与 载体DNA 进行组合形成重组DNA，然后导入 受体细胞 ，并使其在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术。 操作环境 生物体外 操作对象 基因 操作水平 DNA分子水平 操作原理 基因重组 操作结果 按照人类的需要定向改造生物的遗传特性 意义： 定向改造生物性状 ；克服远缘杂交不亲和障碍 1．请列举基因重组的类型。 提示　(1)真核生物有性生殖过程中，减数分裂时发生的基因重组：①交换型，同源染色体非姐妹染色单体互换；②自由组合型，非同源染色体的自由组合。 (2)肺炎链球菌的转化实验中发生的基因重组：S型细菌的DNA进入R型细菌并使R型细菌转化为S型细菌。 (3)基因工程中人工操作导致的基因重组。 2．为什么不同生物的DNA可拼接在一起？ 提示　几乎所有生物的DNA分子都是由4种脱氧核苷酸形成的规则的双螺旋结构。 3．一种生物的基因可在不同生物体内表达的原因是什么？ 提示　所有生物都共用一套遗传密码；遗传信息传递都遵循中心法则；基因是控制性状的结构与功能的基本单位 二、基因工程的工具酶 1．限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 来源 主要来自原核生物 种类及命名 数千种；命名： 作用 识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 结果 产生黏性末端或平末端 （1）限制酶存在于原核生物中的作用是什么？ 一种防御工具，用来切割外源DNA，使之失效，以保证自身安全。 （2）为什么限制酶不切割自身的DNA分子？ 含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 (3) ①如下图所示，EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是—GAATTC—，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是—CCCGGG—，切割位点在C和G之间；说明限制酶具有特异性。 ②请判断：以下黏性末端是由 3 种限制酶作用产生的，他们的识别序列分别是：—GAATTC—；—CAATTG——GAATTC— 2．DNA连接酶——“分子缝合针” (1)作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 (2)种类 种类 来源 特点 E.coli DNA连接酶 大肠杆菌 只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段 T4 DNA连接酶 T4噬菌体 既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率相对较低 易错警示　 限制酶与DNA连接酶的作用部位和作用区别：限制酶和DNA连接酶都作用于特定部位的磷酸二酯键，但前者是“切割”，后者是“缝合”。 易错提醒　与DNA相关的几种酶的比较 项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶 作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键 作用对象 DNA片段 DNA 单个的脱氧核苷酸 DNA 作用结果 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链 下图是4种限制酶的识别序列及其酶切位点，请思考回答下列问题： (1)图中限制酶1和2分别切割DNA后会产生黏性末端，限制酶3和4分别切割DNA后会产生平末端。 (2)限制酶1和2分别切割DNA后会产生相同的黏性末端。 (3)经酶1和酶2分别切割DNA分子，连接形成重组DNA分子后，重组DNA分子仍能被限制酶2识别。 (4)用酶3和酶4分别切割DNA后，其产物经T4_DNA连接酶催化能连接形成重组DNA分子。 归纳总结　不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端一定是相同的，不同类型的限制酶切割后也可能产生相同的黏性末端。这样可以使切割位点的选择扩大 三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 1．种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等。 2．常用载体——质粒 (1)本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 (2)质粒作为载体所具备的条件及原因 条件 原因 稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上 能使目的基因稳定存在且数量可扩增 有一个至多个限制酶切割位点 可携带多个或多种外源基因 具有特殊的标记基因 便于重组DNA分子的筛选 无毒害作用 对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤 (3)作用 ①作为运输工具，将外源基因导入细胞。 ②质粒携带外源基因在细胞内大量复制。 1.如图所示为大肠杆菌及质粒的结构模式图，据图探究以下问题： (1)a代表的物质和质粒都能进行自我复制，它们的化学本质都是DNA。 (2)某外源基因切割末端为，若质粒也可用同种限制酶处理，质粒应有的一段核苷酸序列及被该限制酶切割的末端分别是什么？ 提示　—ACGCGT—　CGCGT— 　 —TGCGCA—；　　  A— (3)氨苄青霉素抗性基因，能控制某物质的合成，该物质能抵抗氨苄青霉素，使含有该基因的生物能在含氨苄青霉素的环境中存活。因此，氨苄青霉素抗性基因在基因工程载体上能起什么作用？ 提示　用作标记基因，便于重组DNA的筛选。 (4)由以上分析总结作为载体必须具备哪些条件？ 提示　作为载体必须具备的条件：①必须有一个至多个限制酶切割位点；②必须具备自我复制的能力；③必须有特殊的标记基因。 实验突破(一)　DNA的粗提取与鉴定 一、实验原理 1．提取DNA的原理 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 如：(1)DNA在酒精溶液中的溶解性：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。 (2)DNA在NaCl溶液中的溶解性：DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2 mol/L的NaCl溶液。 2．鉴定DNA的原理 在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 3. 试剂作用：95%酒精： 析出DNA ；2mol/L 的NaCl溶液： 溶解DNA ； 研磨液：溶解并提取DNA 二、方法步骤 1．称取约30 g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL研磨液，充分研磨。 2．去除滤液中的杂质 方案一 在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4 ℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液 方案二 直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1 500 r/min的转速下离心5 min，再取上清液 3.DNA的析出 方案一 在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3 min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA；用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分 方案二 将溶液倒入塑料离心管中，在10 000 r/min的转速下离心5 min，弃上清液，将管底的沉淀物晾干 4.DNA的鉴定 取两支20 mL的试管，各加入2 mol/L的NaCl溶液5 mL。将丝状物或沉淀物溶解于其中一支试管的NaCl溶液中，再向两支试管中加入4 mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5 min，待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。 5.实验结果的评价 （1）DNA纯度：看提取物颜色的亮度 （2）DNA的量：看与二苯胺试剂反应颜色的深浅 三、操作提示 1．以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止血液凝固。 2．加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。 四、关键点拨 1．利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。 2．不能选用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核。 3．提纯DNA时，选用体积分数为95%的冷酒精的原因：95%的冷酒精提纯效果更佳。 1. 过滤或离心取上清液时，低温放置几分钟的作用是什么？ 抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出； 2．酒精预冷的作用是什么？ 低温可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； 低温抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出； 低温有利于增加DNA的柔韧性，减少断裂。 3.有时还会反复利用不同浓度的NaCl溶液来溶解、析出DNA，试猜想该操作的目的？ 进一步纯化DNA 第2节　基因工程的基本操作程序 基因工程的基本操作程序（主要包括四个步骤）： 目的基因的 筛选与获取 → 基因表达载体 的构建（核心操作步骤）→ 将 目的基因 导入 受体细胞 → 目的基因的 检测与鉴定 一、目的基因的筛选与获取 1．目的基因的筛选 目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。目的基因也可以是一些具有调控作用的因子，调控其它基因的表达。不是所有的基因都编码蛋白质或肽链。 (1) 筛选合适的目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。 (2) 认识基因结构和功能的技术方法：随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。 1. Bt抗虫蛋白的抗虫原理？ 当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡 2. 抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？ Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响 2.目的基因的获取 获取目的基因的方法：①通过构建 基因文库 来获取目的基因；②人工合成目的基因 ③利用 PCR 特异性地快速扩增目的基因 (1)利用PCR获取和扩增目的基因 ①PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在生物体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 ②目的：快速扩增目的基因。 ③原理：DNA半保留复制。 ④基本条件：基 DNA模板 （提供DNA复制的模板）、 2种引物 （为DNA聚合酶提供了游离的3'端）、 四种脱氧核苷酸 （合成子链DNA的原料）、 Taq DNA聚合酶 （催化合成DNA子链）。PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，提供相对稳定的pH环境；一般添加Mg2+，真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。控制温度，使DNA复制在体外反复进行。 ⑤过程 a．变性：当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链。 b．复性：温度下降至50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 c．延伸：温度升至72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 ⑥结果：每一次循环后，目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n，n为扩增循环的次数)。 ⑦鉴定：采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。 ⑧仪器：PCR扩增仪。 图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答： (1)图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？ 提示　第3轮。 (2)图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，请分别说明理由。 提示　第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。 第2组：引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。 (3)要保证目的基因能与载体正相连接，还要对引物进行什么操作？ 提示　要在两种引物的5′端分别添加上不同限制酶的识别序列。 （4）设计引物的前提条件是什么？为什么要设计引物？ 要有一段已知目的基因的核苷酸序列 DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3′端开始延伸DNA链。 (5) 根据PCR技术找出以下规律： ①n代后，DNA分子有2n个 ②n代后，DNA链有2n+1条 ③第3代出现完整的目的基因 ④n代后，含引物的DNA分子有2n个 ⑤n代后，含其中一种引物的DNA分子有2n-1个 ⑥n代后，共消耗2n+1-2个引物 ⑦第n代复制，消耗了2n个引物 ⑧n代后，完整的(等长）目的基因有2n-2n个 （6）用PCR可以扩增mRNA吗？ mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。 （2）人工合成法 ①前提：基因比较小、核苷酸序列已知 ,例如：在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家人工合成了目的基因。 （3）从基因文库中获取 ①种类： 基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。 部分基因组文库：含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体 ②构建过程： 基因组文库：基因组DNA限制酶酶切--- 拼接质粒，导入细菌中保存为文库 部分基因组文库（cDNA文库）：mRNA逆转录得cDNA---拼接质粒，导入细菌中保存为文库 原核细胞 真核细胞 不同点 编码区是连续的 编码区是间隔的、不连续的 相同点 都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成的 （1）原核细胞与真核细胞的基因结构比较 （2） 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小 小 大 基因中启动子 无 有 基因中内含子 无 有 基因多少 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 物种间基因交流 可以 部分基因可以 （3）如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，一定会产生原来的蛋白质吗？为什么？ 不一定 ①原核生物细胞里没有相应的机制来去除内含子； ②原核生物没有真核的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等） 二、基因表达载体的构建 1．基因表达载体构建的目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 2．基因表达载体的组成 3．基因表达载体的构建过程 一般用同种或能产生相同末端的限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处(如图所示)。 1．请区分启动子和终止子与起始密码子和终止密码子：启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分，而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。 2．下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请据图回答下列问题： 限制酶 BamHⅠ HindⅢ EcoRⅠ SmaⅠ 识别序列及切割位点 (1)构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ酶切割质粒？为什么？ 提示　不能；因为SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因。质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。 (2)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？提示　可以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接。 归纳总结　如何选择限制酶 (1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 ②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst Ⅰ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)切割。 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 ①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。 ②质粒作为载体必须具有标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构。 (3)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能表达，即酶切位点应位于启动子与终止子之间。 三、将目的基因导入受体细胞 1．转化的含义 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2．转化的方法：①导入植物细胞：花粉管通道（我国独创的方法）、 农杆菌转化法 ； ②导入动物细胞： 显微注射法 ； ③导入微生物细胞： Ca2+处理法 （使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态）。 (1)导入植物细胞 ①花粉管通道法：可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。受体细胞：一般为受精卵 ②农杆菌转化法：将目的基因导入双子叶植物和裸子植物时最常用的方法。受体细胞：体细胞或受精卵 归纳总结该过程经过 两 次拼接、 两 次导入： ①第一次拼接：将 目的基因 拼接到Ti质粒的 T-DNA上 ②第二次拼接：农杆菌将插入 目的基因的T-DNA 拼接到受体细胞染色体的 DNA上 上（非人工操作） ③第一次导入：将含目的基因的 Ti质粒 重新导入农杆菌④第二次导入：农杆菌将含 目的基因的T-DNA 导入 受体细胞 （非人工操作） a．农杆菌的特点：农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的TDNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 b．方法步骤：目的基因插入Ti质粒的TDNA中→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达。 (2)导入动物细胞 ①方法：显微注射技术。 ②常用受体细胞：受精卵。 (3)导入微生物细胞：常以大肠杆菌作为受体细胞，一般先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。 1．用花粉管通道法导入受体细胞的目的基因是否需要和载体结合？试分析原因。 提示　需要。因为目的基因只有和载体结合成基因表达载体才容易在受体细胞中稳定维持和表达。 2．将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？ 提示　基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，利于重组质粒的导入。 3．植物基因工程常用的受体细胞为什么可以是体细胞，而动物基因工程一般只用受精卵？ 提示　植物体细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程形成完整植物体，因此受体细胞可以是体细胞；动物体细胞的全能性受到严格限制，因此动物基因工程中的受体细胞一般只用受精卵。 4．科学家将外源基因导入绵羊的受精卵中，由于外源基因可能随机插入到受精卵的DNA中，因而有时会导致早期胚胎死亡，请分析可能的原因是什么？ 提示　外源基因的插入可能使受精卵内生命活动必需的某些基因不能正常表达，因而有时会导致早期胚胎死亡。 5．将胰岛素基因的表达载体导入大肠杆菌，从大肠杆菌中获得的“胰岛素”未能达到期待的生物活性，导致这种差异的原因可能是什么？ 提示　大肠杆菌是原核生物，无内质网、高尔基体等细胞器，大肠杆菌中基因表达获得的蛋白质未经加工。 四、目的基因的检测与鉴定 1、目的：检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其 遗传特性 。 2、分子水平的检测： (1)导入水平： ①检测目的：检测受体细胞的 染色体的DNA 上是否插入了 目的基因 。 ②技术手段： PCR 等技术。 (2)转录水平： ①检测目的：检测目的基因是否转录出了 mRNA 。 ②技术手段： PCR 等技术。 (3)翻译水平： ①检测目的：检测目的基因是否 翻译成蛋白质 。 ②技术手段： 抗原-抗体杂交检测 技术。 3、个体水平的鉴定 (1)鉴定目的：检测个体是否具有 相应性状 。 (2)鉴定方法： 抗虫鉴定 （如通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫）、 抗病鉴定 、活性鉴定等。 实验突破(二)　DNA片段的扩增及电泳鉴定 一、实验原理 1．DNA片段的扩增 利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。 2．琼脂糖凝胶电泳 (1)带电粒子：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电荷或负电荷。 (2)迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 (3)迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子本身的大小和构象有关。 (4)检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。 二、方法步骤 1．移液：用微量移液器按照配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组成成分。 2．混合：待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。 3．离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10 s，使反应液集中在管的底部。 4．反应：将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应。 5．根据待分离的DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制合适的琼脂糖凝胶，一般配制质量体积比为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液，并加入适量的核酸染料混匀。 6．将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔。 7．接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5_V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 8．电泳结束后，取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 三、操作提示 1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 3. 该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 4. PCR扩增不能随意加大试剂用量。 四、关键点拨 1．PCR中的解旋过程：PCR过程中不需要(填“需要”或“不需要”)解旋酶，需要通过升高温度打开氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键，因此，DNA加热变性后变为单链，并未分解成单体。 2．PCR需要两种引物，它们分别是能与两条DNA母链的一段碱基序列互补配对的核酸单链。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸，引物自身不能有连续4个碱基的互补序列，两种引物之间不能有连续4个碱基的互补序列。 3．PCR循环之前，常要进行一次预变性，预变性的目的是增加大分子模板DNA彻底变性的概率。 4．判断DNA扩增成功的方法：(1)可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。(2)电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。 第3节　 基因工程的应用 一、基因工程在农牧业方面的应用 1．转基因抗虫植物 (1)方法：从某些生物中分离出具有抗虫功能的基因，将它导入作物中培育出具有抗虫性的作物。 (2)成果：转基因抗虫棉花、玉米、大豆、水稻和马铃薯等。 2．转基因抗病植物 (1)背景：许多栽培作物由于自身缺少抗病基因，因此用常规育种的方法很难培育出抗病新品种。 (2)方法：将来源于某些病毒、真菌等的抗病基因导入植物，培育出转基因抗病植物。 (3)成果：转基因抗病毒甜椒、番木瓜和烟草等。 3．转基因抗除草剂植物 (1)背景：杂草常常危害农业生产，而大多数除草剂不仅能杀死田间杂草，还会损伤作物，导致作物减产。(2)方法：将降解或抵抗某种除草剂的基因导入作物，可以培育出抗除草剂的作物品种。 (3)成果：转基因抗除草剂玉米、大豆、油菜和甜菜等。 4．改良植物的品质 优良基因 成果 必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因 富含赖氨酸的转基因玉米 与植物花青素代谢有关的基因 转基因矮牵牛 5.提高动物的生长速率 (1)基因：外源生长激素基因。 (2)成果：转基因鲤鱼。 6．改善畜产品的品质 (1)基因：肠乳糖酶基因。 (2)成果：转基因牛分泌的乳汁中，乳糖含量大大降低，而其他营养成分不受影响。 1．从环境保护角度出发，分析转基因抗虫棉与普通棉相比在害虫防治方面的优越性。 提示　减少了化学农药的使用量，降低了环境污染。 2．种植转基因抗虫棉若干年后，害虫会不会对转基因抗虫棉产生抗性？为什么？ 提示　会；害虫会因遗传物质发生改变产生对转基因抗虫棉的抗性。 二、基因工程在医药卫生领域的应用 1．利用微生物或动植物细胞生产药物 成果：细胞因子、抗体、疫苗、激素等。 2．利用哺乳动物生产药物 (1)方法：将药用蛋白基因和乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中，由该受精卵发育成的转基因动物在进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物。(2)成果：利用乳腺生物反应器生产抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素、α抗胰蛋白酶等。 3．建立移植器官工厂 人体器官移植的难题：人体移植器官短缺是世界性难题 解决途径：寻求可替代的移植器官，如用猪的器官来解决人类器官移植的来源问题。 猪的优点： a.猪的内脏构造、大小、血管分布与人极为相似 b.猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒远远少于灵长类动物 最大难题：免疫排斥 改造方法： a.在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达； b.设法除去抗原决定基因，然后再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。 1. 1.干扰素的化学本质是什么？干扰素的作用机理是怎样的？ 糖蛋白 干扰病毒复制 2. 传统生产干扰素的方法是什么？ 从人血液中的白细胞内提取 3. 乳腺生物反应器的药用蛋白基因存在于转基因动物的哪些细胞中？ 几乎所有细胞 4. 为什么将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起？ 让药用蛋白基因只在乳腺细胞中特异性表达 5. 研制膀胱生物反应器时，应如何处理目的基因？ 将目的基因与膀胱上皮细胞中特异表达的基因的启动子重组 6. 膀胱生物反应器哪些方面优于乳腺生物反应器？ 不局限于性别与生长期 7. 用生物反应器生产药物的优点？ 产物容易提取 产量高 质量好 成本低 三、基因工程在食品工业方面的应用 1.基因工程菌 概念：用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类。 应用：利用基因工程菌，除了可以生产药物，还能生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。 2.实例 ①阿斯巴甜：一种普遍使用的甜味剂，主要由天冬氨酸和苯丙氨酸形成，这两种氨基酸可通过基因工程实现大规模生产。 ②凝乳酶： 应用：奶酪生产中用来凝聚固化奶中的蛋白质。 传统方法：杀死未断奶的小牛，取出第四胃的黏膜进行提取。 现代制备方法：将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过工业发酵批量生产凝乳酶。 ③淀粉酶、脂酶 应用：加工转化糖浆需要淀粉酶 加工烘烤食品、制造生物能源要用到脂酶 制备方法：构建基因工程菌，然后用发酵技术大量生产。 优点：和天然产物中提取的酶相比，基因工程获得的工业用酶的纯度更高，生产成本显著降低，生产效率较高。 乳腺生物反应器与工程菌生产药物的区别 比较内容 乳腺生物反应器 工程菌 含义 指让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系 基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白质相同 细菌合成的药物蛋白可能没有活性 受体细胞 动物受精卵 微生物细胞 目的基因导入方式 显微注射法 Ga+处理法 生产条件 不需严格灭菌；温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件 第4节　蛋白质工程的原理和应用 1．蛋白质工程 (1)基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。 (2)手段：通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质。 (3)目的：获得满足人类生产和生活需求的蛋白质。 (4)困难：蛋白质发挥功能必须依赖正确的高级结构，而蛋白质的高级结构十分复杂。 2．蛋白质工程崛起的缘由 (1)崛起缘由 ①基因工程的实质：将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状。 ②基因工程的不足：基因工程在原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质。 ③天然蛋白质的不足：天然蛋白质的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。 (2)实例：提高玉米赖氨酸含量 改造后玉米叶片和种子中游离赖氨酸含量分别提高5倍和2倍。 3．蛋白质工程的基本原理 1、目标：根据人们对蛋白质 功能 的特定需求，对蛋白质的 结构 行设计改造。 2、实质：改造或合成 基因 ，来定向改造现有蛋白质，或制造新的蛋白质。 3、基本思路（中心法则的逆推，与天然蛋白质合成的过程相反）： 预期的 蛋白质功能 设计预期的 蛋白质结构 推测应有的 氨基酸序列 找到并改变相对应的 脱氧核苷酸 序列（基因）或合成 新基因 获得所需的蛋白质 4．蛋白质工程的应用 1、医药工业方面 （1）研发速效胰岛素类似物 天然蛋白质易形成二聚体或六聚体 → 预期功能： 抑制 胰岛素的聚合作用→设计结构：改变B链第20～29位氨基酸组成 → 推测序列：B28位脯氨酸替换为__天冬氨酸__或将它与B29位的_赖氨酸_交换位置→改造形成新胰岛素基因 → 转录形成mRNA → 翻译形成多肽链 → 折叠形成___蛋白质（预期结构）___ → 行使功能：有效 抑制 胰岛素的聚合。 （2）延长干扰素体外保存时间 天然干扰素不易保存→预期功能： 延长 保存时间 → 设计结构：氨基酸替换 → 推测序列：一个半胱氨酸变成__丝氨酸___ → 改造形成新干扰素基因 → 转录形成mRNA → 翻译形成多肽链 → 折叠形成_蛋白质（预期结构）_ → 行使功能：在 -70℃ 下可以保存半年。 （3）降低人对小鼠单抗隆抗体的免疫反应 通过__改造基因__，将小鼠抗体上结合__抗原_的区域（即可变区）“嫁接”到人的__抗体__（即恒定区）上，经过这样改造的抗体诱发免疫反应的强度就会_减低_很多。 2、农业方面 （1）_改造__某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用的速率，增加粮食的产量。 （2）利用蛋白质工程的思路设计优良微生物农药，通过改造微生物蛋白质的 结构 ，使它防治病虫害的效果 增强 。 蛋白质工程是一项难度很大的工程，主要是因为蛋白质发挥功能必须依赖于正确的_高级结构__，而这种___高级结构____往往十分复杂。要设计出更加符合__人类需求_的蛋白质，还需要不断地攻坚克难。随着科技的深入发展，蛋白质工程将会给人类带来更多的福祉。 (3)农业方面 ①科学家尝试改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用的效率，增加粮食的产量。 ②科学家利用蛋白质工程的思路设计优良微生物农药，通过改造微生物蛋白质的结构，增强微生物防治病虫害的效果。 1．为什么蛋白质工程需直接改造基因，而不直接改造蛋白质？ (1)任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造的蛋白质也是无法遗传的。 (2)对基因进行改造比对蛋白质直接改造更容易操作，难度要小得多。 2．基因工程和蛋白质工程的区别 (1)通过基因判断：若基因的编码蛋白序列未经改造，则为基因工程，反之，则为蛋白质工程。 (2)通过蛋白质判断：若生产出的蛋白质是天然蛋白质，则为基因工程，反之，则为蛋白质工程。 第2页 共12页 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$ 第1页 共 12 页 学科网（北京）股份有限公司 第三章 基因工程 第 1节 重组 DNA技术的基本工具 一、基因工程的概念 概念：是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，将外源 目的基因 与 载体 DNA 进行组合形成重组 DNA， 然后导入 受体细胞 ，并使其在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术。 操作环境 生物体外 操作对象 基因 操作水平 DNA 分子水平 操作原理 基因重组 操作结果 按照人类的需要定向改造生物的遗传特性 意义： 定向改造生物性状 ；克服远缘杂交不亲和障碍 1．请列举基因重组的类型。 提示 (1)真核生物有性生殖过程中，减数分裂时发生的基因重组：①交换型，同源染色体非姐妹染色单体互换；② 自由组合型，非同源染色体的自由组合。 (2)肺炎链球菌的转化实验中发生的基因重组：S型细菌的 DNA进入 R型细菌并使 R型细菌转化为 S型细菌。 (3)基因工程中人工操作导致的基因重组。 2．为什么不同生物的 DNA可拼接在一起？ 提示 几乎所有生物的 DNA分子都是由 4种脱氧核苷酸形成的规则的双螺旋结构。 3．一种生物的基因可在不同生物体内表达的原因是什么？ 提示 所有生物都共用一套遗传密码；遗传信息传递都遵循中心法则；基因是控制性状的结构与功能的基本单位 二、基因工程的工具酶 1．限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 来源 主要来自原核生物 种类及命名 数千种；命名： 作用 识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列，使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 结果 产生黏性末端或平末端 （1）限制酶存在于原核生物中的作用是什么？ 一种防御工具，用来切割外源 DNA，使之失效，以保证自身安全。 （2）为什么限制酶不切割自身的 DNA分子？ 含某种限制酶的细菌的 DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的 碱基上，使限制酶不能将其切开。 (3) ①如下图所示，EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是—GAATTC—，切割位点在 G 和 A 之间；SmaⅠ限制酶识别的碱 基序列是—CCCGGG—，切割位点在 C和 G之间；说明限制酶具有特异性。 第2页 共 12 页 学科网（北京）股份有限公司 ②请判断：以下黏性末端是由 3 种限制酶作用产生的，他们的识别序列分别是：—GAATTC—；—CAATTG—— GAATTC— 2．DNA 连接酶——“分子缝合针” (1)作用：将两个 DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 (2)种类 种类 来源 特点 E.coli DNA连接酶 大肠杆菌 只能将具有互补黏性末端的 DNA片段连接起来，不 能连接具有平末端的 DNA片段 T4 DNA连接酶 T4 噬菌体 既可以“缝合”双链 DNA片段互补的黏性末端，又 可以“缝合”双链 DNA片段的平末端，但连接平末 端的效率相对较低 易错警示 限制酶与 DNA连接酶的作用部位和作用区别：限制酶和 DNA连接酶都作用于特定部位的磷酸二酯键，但前者是“切 割”，后者是“缝合”。 易错提醒 与 DNA相关的几种酶的比较 项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶 作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键 作用对象 DNA片段 DNA 单个的脱氧核苷酸 DNA 作用结果 将两个 DNA片段连接 成完整的 DNA 分子 切割 DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连 接到 DNA单链末端 将双链 DNA分子局部 解旋为单链 下图是 4种限制酶的识别序列及其酶切位点，请思考回答下列问题： (1)图中限制酶 1和 2分别切割 DNA 后会产生黏性末端，限制酶 3和 4分别切割 DNA后会产生平末端。 (2)限制酶 1和 2分别切割 DNA后会产生相同的黏性末端。 (3)经酶 1和酶 2分别切割 DNA分子，连接形成重组 DNA分子后，重组 DNA分子仍能被限制酶 2识别。 (4)用酶 3和酶 4分别切割 DNA后，其产物经 T4_DNA连接酶催化能连接形成重组 DNA分子。 归纳总结 不同 DNA 分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端一定是相同的，不同类型的限制酶切割后 也可能产生相同的黏性末端。这样可以使切割位点的选择扩大 三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 1．种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等。 2．常用载体——质粒 (1)本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核 DNA 之外，并具有自我复制能力 的环状双链 DNA分子。 (2)质粒作为载体所具备的条件及原因 条件 原因 稳定存在并能自我复制或整合到受体 DNA上 能使目的基因稳定存在且数量可扩增 有一个至多个限制酶切割位点 可携带多个或多种外源基因 具有特殊的标记基因 便于重组 DNA分子的筛选 无毒害作用 对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤 (3)作用 第3页 共 12 页 学科网（北京）股份有限公司 ①作为运输工具，将外源基因导入细胞。 ②质粒携带外源基因在细胞内大量复制。 1.如图所示为大肠杆菌及质粒的结构模式图，据图探究以下问题： (1)a代表的物质和质粒都能进行自我复制，它们的化学本质都是 DNA。 (2)某外源基因切割末端为 —A—TGCGC ，若质粒也可用同种限制酶处理，质粒应有的一段核苷酸序列及被该限制 酶切割的末端分别是什么？ 提示 —ACGCGT— CGCGT— —TGCGCA—； A— (3)氨苄青霉素抗性基因，能控制某物质的合成，该物质能抵抗氨苄青霉素，使含有该基因的生物能在含氨苄青霉素 的环境中存活。因此，氨苄青霉素抗性基因在基因工程载体上能起什么作用？ 提示 用作标记基因，便于重组 DNA的筛选。 (4)由以上分析总结作为载体必须具备哪些条件？ 提示 作为载体必须具备的条件：①必须有一个至多个限制酶切割位点；②必须具备自我复制的能力；③必须有特 殊的标记基因。 实验突破(一) DNA的粗提取与鉴定 一、实验原理 1．提取 DNA的原理 利用 DNA与 RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取 DNA，去除其他成分。 如：(1)DNA 在酒精溶液中的溶解性：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。 (2)DNA 在 NaCl溶液中的溶解性：DNA在不同浓度的 NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于 2 mol/L的 NaCl溶液。 2．鉴定 DNA的原理 在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 3. 试剂作用：95%酒精： 析出 DNA ；2mol/L 的 NaCl 溶液： 溶解 DNA ； 研磨液：溶解并提取 DNA 二、方法步骤 1．称取约 30 g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入 10 mL研磨液，充分研磨。 2．去除滤液中的杂质 方案一 在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在 4 ℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液 方案二 直接将研磨液倒入塑料离心管中，在 1 500 r/min的转速下离心 5 min，再取上清液 3.DNA的析出 方案一 在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为 95%)，静置 2～3 min，溶液中出现的白色丝 状物就是粗提取的 DNA；用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分 方案二 将溶液倒入塑料离心管中，在 10 000 r/min的转速下离心 5 min，弃上清液，将管底的沉淀物晾干 4.DNA的鉴定 取两支 20 mL的试管，各加入 2 mol/L的 NaCl溶液 5 mL。将丝状物或沉淀物溶解于其中一支试管的 NaCl溶液中， 第4页 共 12 页 学科网（北京）股份有限公司 再向两支试管中加入 4 mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热 5 min，待试管冷却后，比较两支试 管中溶液颜色的变化。 5.实验结果的评价 （1）DNA纯度：看提取物颜色的亮度 （2）DNA的量：看与二苯胺试剂反应颜色的深浅 三、操作提示 1．以血液为实验材料时，每 100 mL血液中需要加入 3 g柠檬酸钠，防止血液凝固。 2．加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧 DNA 分子的断裂，导致 DNA分子不能形成絮状沉淀。 四、关键点拨 1．利用动物细胞提取 DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。 2．不能选用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核。 3．提纯 DNA时，选用体积分数为 95%的冷酒精的原因：95%的冷酒精提纯效果更佳。 1. 过滤或离心取上清液时，低温放置几分钟的作用是什么？ 抑制核酸水解酶的活性，进而抑制 DNA降解；抑制 DNA分子运动，使 DNA易形成沉淀析出； 2．酒精预冷的作用是什么？ 低温可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制 DNA降解； 低温抑制 DNA 分子运动，使 DNA 易形成沉淀析出； 低温有利于增加 DNA的柔韧性，减少断裂。 3.有时还会反复利用不同浓度的 NaCl溶液来溶解、析出 DNA，试猜想该操作的目的？ 进一步纯化 DNA 第 2节 基因工程的基本操作程序 基因工程的基本操作程序（主要包括四个步骤）： 目的基因的 筛选与获取 → 基因表达载体 的构建（核心操作步骤）→ 将 目的基因 导入 受体细胞 → 目 的基因的 检测与鉴定 一、目的基因的筛选与获取 1．目的基因的筛选 目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要指编码蛋白质 的基因，如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。目的基因也可以是一些具有 调控作用的因子，调控其它基因的表达。不是所有的基因都编码蛋白质或肽链。 (1) 筛选合适的目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。 (2) 认识基因结构和功能的技术方法：随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如 BLAST） 等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。 1. Bt 抗虫蛋白的抗虫原理？ 当 Bt 抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死 亡 2. 抗虫棉中的 Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？ Bt 抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异 性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响 2.目的基因的获取 获取目的基因的方法：①通过构建 基因文库 来获取目的基因；②人工合成目的基因 ③利用 PCR 特异性地快速扩增目的基因 (1)利用 PCR获取和扩增目的基因 ①PCR 的含义：PCR 是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据 DNA 半保留复制的原理，在生物体外提供参与 DNA 复 制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 第5页 共 12 页 学科网（北京）股份有限公司 ②目的：快速扩增目的基因。 ③原理：DNA半保留复制。 ④基本条件：基 DNA 模板 （提供 DNA 复制的模板）、 2 种引物 （为 DNA 聚合酶提供了游离的 3'端）、 四种脱氧核苷酸 （合成子链 DNA 的原料）、 Taq DNA 聚合酶 （催化合成 DNA 子链）。PCR 反应需要在 一定的缓冲溶液中才能进行，提供相对稳定的 pH 环境；一般添加 Mg2+，真核细胞和细菌的 DNA 聚合酶都需要 Mg2+ 激活。控制温度，使 DNA 复制在体外反复进行。 ⑤过程 a．变性：当温度上升到 90 ℃以上时，双链 DNA解聚为单链。 b．复性：温度下降至 50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA结合。 c．延伸：温度升至 72 ℃左右时，溶液中的 4种脱氧核苷酸在耐高温的 DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原 则合成新的 DNA链。 ⑥结果：每一次循环后，目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增(约为 2 n ，n为扩增循环的次数)。 ⑦鉴定：采用琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR产物。 ⑧仪器：PCR扩增仪。 图 1、图 2分别是 PCR扩增技术相关过程，请思考回答： (1)图 1 所示利用 PCR 技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的 DNA 片段？ 提示 第 3轮。 (2)图 2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，请分别说明理由。 提示 第 1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。 第 2组：引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。 (3)要保证目的基因能与载体正相连接，还要对引物进行什么操作？ 提示 要在两种引物的 5′端分别添加上不同限制酶的识别序列。 （4）设计引物的前提条件是什么？为什么要设计引物？ 要有一段已知目的基因的核苷酸序列 DNA聚合酶不能从头合成 DNA，只能从引物的 3′端开始延伸 DNA链。 (5) 根据 PCR 技术找出以下规律： ①n代后，DNA分子有 2 n 个 ②n代后，DNA链有 2 n+1 条 ③第 3代出现完整的目的基因 ④n代后，含引物的 DNA分子有 2 n 个 ⑤n代后，含其中一种引物的 DNA 分子有 2 n -1个 ⑥n代后，共消耗 2 n+1 -2个引物 第6页 共 12 页 学科网（北京）股份有限公司 ⑦第 n代复制，消耗了 2 n 个引物 ⑧n代后，完整的(等长）目的基因有 2 n -2n个 （6）用 PCR 可以扩增 mRNA吗？ mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成 cDNA再进行扩增。 （2）人工合成法 ①前提：基因比较小、核苷酸序列已知 ,例如：在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学 家人工合成了目的基因。 （3）从基因文库中获取 ①种类： 基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组 DNA的克隆群体。 部分基因组文库：含有某种生物部分基因片段的重组 DNA的克隆群体 ②构建过程： 基因组文库：基因组 DNA限制酶酶切--- 拼接质粒，导入细菌中保存为文库 部分基因组文库（cDNA文库）：mRNA逆转录得 cDNA---拼接质粒，导入细菌中保存为文库 （1）原核细胞与真核细胞的基因结构比较 （2） 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小 小 大 基因中启动子 无 有 基因中内含子 无 有 基因多少 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 物种间基因交流 可以 部分基因可以 （3）如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，一定会产生原来的蛋白质吗？为什么？ 不一定 ①原核生物细胞里没有相应的机制来去除内含子； ②原核生物没有真核的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等） 二、基因表达载体的构建 1．基因表达载体构建的目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 2．基因表达载体的组成 3．基因表达载体的构建过程 一般用同种或能产生相同末端的限制酶分别切割载体和含有目的基因的 DNA片段，再利用 DNA连接酶将目的基因片 段拼接到载体的切口处(如图所示)。 原核细胞 真核细胞 不同点 编码区是连续的 编码区是间隔的、不连续的 相同点 都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成的 第7页 共 12 页 学科网（北京）股份有限公司 1．请区分启动子和终止子与起始密码子和终止密码子：启动子和终止子位于 DNA上，是基因表达载体必需的部分， 而起始密码子和终止密码子位于 mRNA上，决定翻译的开始和结束。 2．下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图 1、图 2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请据图回答下 列问题： 限制酶 BamHⅠ HindⅢ EcoRⅠ SmaⅠ 识别序列及切割位点 (1)构建基因表达载体时，能否用 SmaⅠ酶切割质粒？为什么？ 提示 不能；因为 SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因。质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组 DNA 分子的筛选，若被 破坏，无法进一步筛选。 (2)与只使用 EcoRⅠ相比较，使用 BamHⅠ和 HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源 DNA 的优点是什么？提示 可 以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接。 归纳总结 如何选择限制酶 (1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择 PstⅠ。 ②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择 SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用 Pst Ⅰ和 EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)切割。 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 ①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。 ②质粒作为载体必须具有标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构。 (3)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能表达， 即酶切位点应位于启动子与终止子之间。 三、将目的基因导入受体细胞 1．转化的含义 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2．转化的方法：①导入植物细胞：花粉管通道（我国独创的方法）、 农杆菌转化法 ； 第8页 共 12 页 学科网（北京）股份有限公司 ②导入动物细胞： 显微注射法 ； ③导入微生物细胞： Ca2+处理法 （使细胞处于一种能吸收周围环 境中 DNA 分子的生理状态）。 (1)导入植物细胞 ①花粉管通道法：可以用微量注射器将含目的基因的 DNA 溶液直接注入子房中；可以在植物受粉后的一定时间内， 剪去柱头，将 DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。受体细胞：一般为受精卵 ②农杆菌转化法：将目的基因导入双子叶植物和裸子植物时最常用的方法。受体细胞：体细胞或受精卵 归纳总结 该过程经过 两 次拼接、 两 次导入： ①第一次拼接：将 目的基因 拼接到 Ti 质粒的 T-DNA 上 ②第二次拼接：农杆菌将插入 目的基因的 T-DNA 拼接到受体细胞染 色体的 DNA 上 上（非人工操作） ③第一次导入：将含目的基因的 Ti 质粒 重新导入农杆菌④第二次导 入：农杆菌将含 目的基因的 T-DNA 导入 受体细胞 （非人工操 作） a．农杆菌的特点：农杆菌细胞内含有 Ti质粒，当它侵染植物细胞后， 能将 Ti质粒上的 TDNA(可转移的 DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体 DNA上。 b．方法步骤：目的基因插入 Ti 质粒的 TDNA 中→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因插入植物细胞中的染色体 DNA 上→目的基因表达。 (2)导入动物细胞 ①方法：显微注射技术。 ②常用受体细胞：受精卵。 (3)导入微生物细胞：常以大肠杆菌作为受体细胞，一般先用 Ca 2＋ 处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围 环境中 DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。 1．用花粉管通道法导入受体细胞的目的基因是否需要和载体结合？试分析原因。 提示 需要。因为目的基因只有和载体结合成基因表达载体才容易在受体细胞中稳定维持和表达。 2．将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？ 提示 基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用 Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态，利于重组质粒的导入。 3．植物基因工程常用的受体细胞为什么可以是体细胞，而动物基因工程一般只用受精卵？ 提示 植物体细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程形成完整植物体，因此受体细胞可以是体细胞；动物体细 胞的全能性受到严格限制，因此动物基因工程中的受体细胞一般只用受精卵。 4．科学家将外源基因导入绵羊的受精卵中，由于外源基因可能随机插入到受精卵的 DNA 中，因而有时会导致早期 胚胎死亡，请分析可能的原因是什么？ 提示 外源基因的插入可能使受精卵内生命活动必需的某些基因不能正常表达，因而有时会导致早期胚胎死亡。 5．将胰岛素基因的表达载体导入大肠杆菌，从大肠杆菌中获得的“胰岛素”未能达到期待的生物活性，导致这种 差异的原因可能是什么？ 提示 大肠杆菌是原核生物，无内质网、高尔基体等细胞器，大肠杆菌中基因表达获得的蛋白质未经加工。 四、目的基因的检测与鉴定 1、目的：检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其 遗传特性 。 2、分子水平的检测： (1)导入水平： ①检测目的：检测受体细胞的 染色体的 DNA 上是否插入了 目的基因 。 ②技术手段： PCR 等技术。 (2)转录水平： ①检测目的：检测目的基因是否转录出了 mRNA 。 ②技术手段： PCR 等技术。 (3)翻译水平： ①检测目的：检测目的基因是否 翻译成蛋白质 。 ②技术手段： 抗原-抗体杂交检测 技术。 第9页 共 12 页 学科网（北京）股份有限公司 3、个体水平的鉴定 (1)鉴定目的：检测个体是否具有 相应性状 。 (2)鉴定方法： 抗虫鉴定 （如通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫）、 抗病鉴定 、活性鉴定等。 实验突破(二) DNA片段的扩增及电泳鉴定 一、实验原理 1．DNA 片段的扩增 利用 PCR可以在体外进行 DNA 片段的扩增。PCR 利用了 DNA 的热变性原理，通过调节温度来控制 DNA双链的解聚与 结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。 2．琼脂糖凝胶电泳 (1)带电粒子：DNA分子具有可解离的基团，在一定的 pH下，这些基团会带上正电荷或负电荷。 (2)迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 (3)迁移速率：在凝胶中 DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子本身的大小和构象有关。 (4)检测：凝胶中的 DNA分子通过染色，可以在波长为 300 nm的紫外灯下被检测出来。 二、方法步骤 1．移液：用微量移液器按照配方或 PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组成成分。 2．混合：待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。 3．离心：将微量离心管放在离心机上，离心约 10 s，使反应液集中在管的底部。 4．反应：将装有反应液的微量离心管放入 PCR仪中，设置程序进行反应。 5．根据待分离的 DNA 片段的大小，用电泳缓冲液配制合适的琼脂糖凝胶，一般配制质量体积比为 0.8%～1.2%的琼 脂糖溶液，并加入适量的核酸染料混匀。 6．将扩增得到的 PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔。 7．接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为 1～5_V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘 时，停止电泳。 8．电泳结束后，取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 三、操作提示 1．为避免外源 DNA 等因素的污染，PCR 实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处 理。 2．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 3. 该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱 拿出，放在冰块上缓慢融化。 4. PCR扩增不能随意加大试剂用量。 四、关键点拨 1．PCR中的解旋过程：PCR过程中不需要(填“需要”或“不需要”)解旋酶，需要通过升高温度打开氢键，但此时 的温度不会破坏磷酸二酯键，因此，DNA加热变性后变为单链，并未分解成单体。 2．PCR 需要两种引物，它们分别是能与两条 DNA母链的一段碱基序列互补配对的核酸单链。用于 PCR的引物长度通 常为 20～30个核苷酸，引物自身不能有连续 4个碱基的互补序列，两种引物之间不能有连续 4个碱基的互补序列。 3．PCR 循环之前，常要进行一次预变性，预变性的目的是增加大分子模板 DNA彻底变性的概率。 4．判断 DNA 扩增成功的方法：(1)可以通过计算 DNA 含量来评价扩增的效果。(2)电泳检测的方法，可以通过在紫 外线下直接观察 DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。 第 3节 基因工程的应用 一、基因工程在农牧业方面的应用 1．转基因抗虫植物 (1)方法：从某些生物中分离出具有抗虫功能的基因，将它导入作物中培育出具有抗虫性的作物。 (2)成果：转基因抗虫棉花、玉米、大豆、水稻和马铃薯等。 2．转基因抗病植物 (1)背景：许多栽培作物由于自身缺少抗病基因，因此用常规育种的方法很难培育出抗病新品种。 第10页 共 12 页 学科网（北京）股份有限公司 (2)方法：将来源于某些病毒、真菌等的抗病基因导入植物，培育出转基因抗病植物。 (3)成果：转基因抗病毒甜椒、番木瓜和烟草等。 3．转基因抗除草剂植物 (1)背景：杂草常常危害农业生产，而大多数除草剂不仅能杀死田间杂草，还会损伤作物，导致作物减产。(2)方法： 将降解或抵抗某种除草剂的基因导入作物，可以培育出抗除草剂的作物品种。 (3)成果：转基因抗除草剂玉米、大豆、油菜和甜菜等。 4．改良植物的品质 优良基因 成果 必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因 富含赖氨酸的转基因玉米 与植物花青素代谢有关的基因 转基因矮牵牛 5.提高动物的生长速率 (1)基因：外源生长激素基因。 (2)成果：转基因鲤鱼。 6．改善畜产品的品质 (1)基因：肠乳糖酶基因。 (2)成果：转基因牛分泌的乳汁中，乳糖含量大大降低，而其他营养成分不受影响。 1．从环境保护角度出发，分析转基因抗虫棉与普通棉相比在害虫防治方面的优越性。 提示 减少了化学农药的使用量，降低了环境污染。 2．种植转基因抗虫棉若干年后，害虫会不会对转基因抗虫棉产生抗性？为什么？ 提示 会；害虫会因遗传物质发生改变产生对转基因抗虫棉的抗性。 二、基因工程在医药卫生领域的应用 1．利用微生物或动植物细胞生产药物 成果：细胞因子、抗体、疫苗、激素等。 2．利用哺乳动物生产药物 (1)方法：将药用蛋白基因和乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺 乳动物的受精卵中，由该受精卵发育成的转基因动物在进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物。(2) 成果：利用乳腺生物反应器生产抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素、α抗胰蛋白酶等。 3．建立移植器官工厂 人体器官移植的难题：人体移植器官短缺是世界性难题 解决途径：寻求可替代的移植器官，如用猪的器官来解决人类器官移植的来源问题。 猪的优点： a.猪的内脏构造、大小、血管分布与人极为相似 b.猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒远远少于灵长类动物 最大难题：免疫排斥 改造方法： a.在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达； b.设法除去抗原决定基因，然后再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。 1. 1.干扰素的化学本质是什么？干扰素的作用机理是怎样的？ 糖蛋白 干扰病毒复制 2. 传统生产干扰素的方法是什么？ 从人血液中的白细胞内提取 3. 乳腺生物反应器的药用蛋白基因存在于转基因动物的哪些细胞中？ 几乎所有细胞 4. 为什么将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起？ 让药用蛋白基因只在乳腺细胞中特异性表达 第11页 共 12 页 学科网（北京）股份有限公司 5. 研制膀胱生物反应器时，应如何处理目的基因？ 将目的基因与膀胱上皮细胞中特异表达的基因的启动子重组 6. 膀胱生物反应器哪些方面优于乳腺生物反应器？ 不局限于性别与生长期 7. 用生物反应器生产药物的优点？ 产物容易提取 产量高 质量好 成本低 三、基因工程在食品工业方面的应用 1.基因工程菌 概念：用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类。 应用：利用基因工程菌，除了可以生产药物，还能生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。 2.实例 ①阿斯巴甜：一种普遍使用的甜味剂，主要由天冬氨酸和苯丙氨酸形成，这两种氨基酸可通过基因工程实现大规 模生产。 ②凝乳酶： 应用：奶酪生产中用来凝聚固化奶中的蛋白质。 传统方法：杀死未断奶的小牛，取出第四胃的黏膜进行提取。 现代制备方法：将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过工业发酵批量生产凝 乳酶。 ③淀粉酶、脂酶 应用：加工转化糖浆需要淀粉酶 加工烘烤食品、制造生物能源要用到脂酶 制备方法：构建基因工程菌，然后用发酵技术大量生产。 优点：和天然产物中提取的酶相比，基因工程获得的工业用酶的纯度更高，生产成本显著降低，生产效率较高。 乳腺生物反应器与工程菌生产药物的区别 比较内容 乳腺生物反应器 工程菌 含义 指让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表 达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 指用基因工程的方法，使外源基因得到高 效表达的菌类细胞株系 基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白质相同 细菌合成的药物蛋白可能没有活性 受体细胞 动物受精卵 微生物细胞 目的基因导入方式 显微注射法 Ga+处理法 生产条件 不需严格灭菌；温度等外界条件对其影响 不大 需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温 度、pH、营养物质浓度等外界条件 第 4节 蛋白质工程的原理和应用 1．蛋白质工程 (1)基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。 (2)手段：通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质。 (3)目的：获得满足人类生产和生活需求的蛋白质。 (4)困难：蛋白质发挥功能必须依赖正确的高级结构，而蛋白质的高级结构十分复杂。 2．蛋白质工程崛起的缘由 (1)崛起缘由 ①基因工程的实质：将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出 新的性状。 ②基因工程的不足：基因工程在原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质。 ③天然蛋白质的不足：天然蛋白质的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需 要。 第12页 共 12 页 学科网（北京）股份有限公司 (2)实例：提高玉米赖氨酸含量 天冬氨酸激酶 第352位的苏氨酸 天冬氨酸激酶 异亮氨酸 二氢吡啶二羧酸合成酶 第104位的天冬酰胺 二氢吡啶二羧酸合成酶 异亮氨酸 改造后玉米叶片和种子中游离赖氨酸含量分别提高 5倍和 2倍。 3．蛋白质工程的基本原理 1、目标：根据人们对蛋白质 功能 的特定需求，对蛋白质的 结构 行设计改造。 2、实质：改造或合成 基因 ，来定向改造现有蛋白质，或制造新的蛋白质。 3、基本思路（中心法则的逆推，与天然蛋白质合成的过程相反）： 4．蛋白质工程的应用 1、医药工业方面 （1）研发速效胰岛素类似物 天然蛋白质易形成二聚体或六聚体 → 预期功能： 抑制 胰岛素的聚合作用→设计结构：改变 B 链第 20～29 位氨基酸组成 → 推测序列：B28 位脯氨酸替换为__天冬氨酸__或将它与 B29 位的_赖氨酸_交换位置 →改造形成新胰岛素基因 → 转录形成 mRNA → 翻译形成多肽链 → 折叠形成___蛋白质（预期结构）___ → 行使功能：有效 抑制 胰岛素的聚合。 （2）延长干扰素体外保存时间 天然干扰素不易保存→预期功能： 延长 保存时间 → 设计结构：氨基酸替换 → 推测序列：一个半胱 氨酸变成__丝氨酸___ → 改造形成新干扰素基因 → 转录形成 mRNA → 翻译形成多肽链 → 折叠形成_蛋 白质（预期结构）_ → 行使功能：在 -70℃ 下可以保存半年。 （3）降低人对小鼠单抗隆抗体的免疫反应 通过__改造基因__，将小鼠抗体上结合__抗原_的区域（即可变区）“嫁接”到人的__抗体__（即恒定 区）上，经过这样改造的抗体诱发免疫反应的强度就会_减低_很多。 2、农业方面 （1）_改造__某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用的速率，增加粮食的产量。 （2）利用蛋白质工程的思路设计优良微生物农药，通过改造微生物蛋白质的 结构 ，使它防治病虫害的效果 增强 。 蛋白质工程是一项难度很大的工程，主要是因为蛋白质发挥功能必须依赖于正确的_高级结构__，而这种 ___高级结构____往往十分复杂。要设计出更加符合__人类需求_的蛋白质，还需要不断地攻坚克难。随着科 技的深入发展，蛋白质工程将会给人类带来更多的福祉。 (3)农业方面 ①科学家尝试改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用的效率，增加粮食的产量。 ②科学家利用蛋白质工程的思路设计优良微生物农药，通过改造微生物蛋白质的结构，增强微生物防治病虫害的效 果。 1．为什么蛋白质工程需直接改造基因，而不直接改造蛋白质？ (1)任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且可以遗传下去。如果对蛋白质 直接改造，即使改造成功，被改造的蛋白质也是无法遗传的。 (2)对基因进行改造比对蛋白质直接改造更容易操作，难度要小得多。 2．基因工程和蛋白质工程的区别 (1)通过基因判断：若基因的编码蛋白序列未经改造，则为基因工程，反之，则为蛋白质工程。 (2)通过蛋白质判断：若生产出的蛋白质是天然蛋白质，则为基因工程，反之，则为蛋白质工程。 预期的 蛋白质功 设计预期的 蛋白质结构 推测应有的 氨基酸序列 找到并改变相对应的 脱氧核苷 酸 序列（基因）或合成 新基 获得所需的蛋白质 第13页 共 12 页 学科网（北京）股份有限公司 第三章 基因工程 第1节　重组DNA技术的基本工具 一、基因工程的概念 概念：是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，将外源 目的基因 与 载体DNA 进行组合形成重组DNA，然后导入 受体细胞 ，并使其在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术。 操作环境 生物体外 操作对象 基因 操作水平 DNA分子水平 操作原理 基因重组 操作结果 按照人类的需要定向改造生物的遗传特性 意义： 定向改造生物性状 ；克服远缘杂交不亲和障碍 1．请列举基因重组的类型。 提示　(1)真核生物有性生殖过程中，减数分裂时发生的基因重组：①交换型，同源染色体非姐妹染色单体互换；②自由组合型，非同源染色体的自由组合。 (2)肺炎链球菌的转化实验中发生的基因重组：S型细菌的DNA进入R型细菌并使R型细菌转化为S型细菌。 (3)基因工程中人工操作导致的基因重组。 2．为什么不同生物的DNA可拼接在一起？ 提示　几乎所有生物的DNA分子都是由4种脱氧核苷酸形成的规则的双螺旋结构。 3．一种生物的基因可在不同生物体内表达的原因是什么？ 提示　所有生物都共用一套遗传密码；遗传信息传递都遵循中心法则；基因是控制性状的结构与功能的基本单位 二、基因工程的工具酶 1．限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 来源 主要来自原核生物 种类及命名 数千种；命名： 作用 识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 结果 产生黏性末端或平末端 （1）限制酶存在于原核生物中的作用是什么？ 一种防御工具，用来切割外源DNA，使之失效，以保证自身安全。 （2）为什么限制酶不切割自身的DNA分子？ 含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 (3) ①如下图所示，EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是—GAATTC—，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是—CCCGGG—，切割位点在C和G之间；说明限制酶具有特异性。 ②请判断：以下黏性末端是由 3 种限制酶作用产生的，他们的识别序列分别是：—GAATTC—；—CAATTG——GAATTC— 2．DNA连接酶——“分子缝合针” (1)作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 (2)种类 种类 来源 特点 E.coli DNA连接酶 大肠杆菌 只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段 T4 DNA连接酶 T4噬菌体 既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率相对较低 易错警示　 限制酶与DNA连接酶的作用部位和作用区别：限制酶和DNA连接酶都作用于特定部位的磷酸二酯键，但前者是“切割”，后者是“缝合”。 易错提醒　与DNA相关的几种酶的比较 项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶 作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键 作用对象 DNA片段 DNA 单个的脱氧核苷酸 DNA 作用结果 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链 下图是4种限制酶的识别序列及其酶切位点，请思考回答下列问题： (1)图中限制酶1和2分别切割DNA后会产生黏性末端，限制酶3和4分别切割DNA后会产生平末端。 (2)限制酶1和2分别切割DNA后会产生相同的黏性末端。 (3)经酶1和酶2分别切割DNA分子，连接形成重组DNA分子后，重组DNA分子仍能被限制酶2识别。 (4)用酶3和酶4分别切割DNA后，其产物经T4_DNA连接酶催化能连接形成重组DNA分子。 归纳总结　不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端一定是相同的，不同类型的限制酶切割后也可能产生相同的黏性末端。这样可以使切割位点的选择扩大 三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 1．种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等。 2．常用载体——质粒 (1)本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 (2)质粒作为载体所具备的条件及原因 条件 原因 稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上 能使目的基因稳定存在且数量可扩增 有一个至多个限制酶切割位点 可携带多个或多种外源基因 具有特殊的标记基因 便于重组DNA分子的筛选 无毒害作用 对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤 (3)作用 ①作为运输工具，将外源基因导入细胞。 ②质粒携带外源基因在细胞内大量复制。 1.如图所示为大肠杆菌及质粒的结构模式图，据图探究以下问题： (1)a代表的物质和质粒都能进行自我复制，它们的化学本质都是DNA。 (2)某外源基因切割末端为，若质粒也可用同种限制酶处理，质粒应有的一段核苷酸序列及被该限制酶切割的末端分别是什么？ 提示　—ACGCGT—　CGCGT— 　 —TGCGCA—；　　  A— (3)氨苄青霉素抗性基因，能控制某物质的合成，该物质能抵抗氨苄青霉素，使含有该基因的生物能在含氨苄青霉素的环境中存活。因此，氨苄青霉素抗性基因在基因工程载体上能起什么作用？ 提示　用作标记基因，便于重组DNA的筛选。 (4)由以上分析总结作为载体必须具备哪些条件？ 提示　作为载体必须具备的条件：①必须有一个至多个限制酶切割位点；②必须具备自我复制的能力；③必须有特殊的标记基因。 实验突破(一)　DNA的粗提取与鉴定 一、实验原理 1．提取DNA的原理 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 如：(1)DNA在酒精溶液中的溶解性：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。 (2)DNA在NaCl溶液中的溶解性：DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2 mol/L的NaCl溶液。 2．鉴定DNA的原理 在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 3. 试剂作用：95%酒精： 析出DNA ；2mol/L 的NaCl溶液： 溶解DNA ； 研磨液：溶解并提取DNA 二、方法步骤 1．称取约30 g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL研磨液，充分研磨。 2．去除滤液中的杂质 方案一 在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4 ℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液 方案二 直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1 500 r/min的转速下离心5 min，再取上清液 3.DNA的析出 方案一 在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3 min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA；用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分 方案二 将溶液倒入塑料离心管中，在10 000 r/min的转速下离心5 min，弃上清液，将管底的沉淀物晾干 4.DNA的鉴定 取两支20 mL的试管，各加入2 mol/L的NaCl溶液5 mL。将丝状物或沉淀物溶解于其中一支试管的NaCl溶液中，再向两支试管中加入4 mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5 min，待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。 5.实验结果的评价 （1）DNA纯度：看提取物颜色的亮度 （2）DNA的量：看与二苯胺试剂反应颜色的深浅 三、操作提示 1．以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止血液凝固。 2．加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。 四、关键点拨 1．利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。 2．不能选用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核。 3．提纯DNA时，选用体积分数为95%的冷酒精的原因：95%的冷酒精提纯效果更佳。 1. 过滤或离心取上清液时，低温放置几分钟的作用是什么？ 抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出； 2．酒精预冷的作用是什么？ 低温可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； 低温抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出； 低温有利于增加DNA的柔韧性，减少断裂。 3.有时还会反复利用不同浓度的NaCl溶液来溶解、析出DNA，试猜想该操作的目的？ 进一步纯化DNA 第2节　基因工程的基本操作程序 基因工程的基本操作程序（主要包括四个步骤）： 目的基因的 筛选与获取 → 基因表达载体 的构建（核心操作步骤）→ 将 目的基因 导入 受体细胞 → 目的基因的 检测与鉴定 一、目的基因的筛选与获取 1．目的基因的筛选 目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。目的基因也可以是一些具有调控作用的因子，调控其它基因的表达。不是所有的基因都编码蛋白质或肽链。 (1) 筛选合适的目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。 (2) 认识基因结构和功能的技术方法：随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。 1. Bt抗虫蛋白的抗虫原理？ 当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡 2. 抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？ Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响 2.目的基因的获取 获取目的基因的方法：①通过构建 基因文库 来获取目的基因；②人工合成目的基因 ③利用 PCR 特异性地快速扩增目的基因 (1)利用PCR获取和扩增目的基因 ①PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在生物体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 ②目的：快速扩增目的基因。 ③原理：DNA半保留复制。 ④基本条件：基 DNA模板 （提供DNA复制的模板）、 2种引物 （为DNA聚合酶提供了游离的3'端）、 四种脱氧核苷酸 （合成子链DNA的原料）、 Taq DNA聚合酶 （催化合成DNA子链）。PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，提供相对稳定的pH环境；一般添加Mg2+，真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。控制温度，使DNA复制在体外反复进行。 ⑤过程 a．变性：当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链。 b．复性：温度下降至50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 c．延伸：温度升至72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 ⑥结果：每一次循环后，目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n，n为扩增循环的次数)。 ⑦鉴定：采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。 ⑧仪器：PCR扩增仪。 图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答： (1)图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？ 提示　第3轮。 (2)图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，请分别说明理由。 提示　第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。 第2组：引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。 (3)要保证目的基因能与载体正相连接，还要对引物进行什么操作？ 提示　要在两种引物的5′端分别添加上不同限制酶的识别序列。 （4）设计引物的前提条件是什么？为什么要设计引物？ 要有一段已知目的基因的核苷酸序列 DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3′端开始延伸DNA链。 (5) 根据PCR技术找出以下规律： ①n代后，DNA分子有2n个 ②n代后，DNA链有2n+1条 ③第3代出现完整的目的基因 ④n代后，含引物的DNA分子有2n个 ⑤n代后，含其中一种引物的DNA分子有2n-1个 ⑥n代后，共消耗2n+1-2个引物 ⑦第n代复制，消耗了2n个引物 ⑧n代后，完整的(等长）目的基因有2n-2n个 （6）用PCR可以扩增mRNA吗？ mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。 （2）人工合成法 ①前提：基因比较小、核苷酸序列已知 ,例如：在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家人工合成了目的基因。 （3）从基因文库中获取 ①种类： 基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。 部分基因组文库：含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体 ②构建过程： 基因组文库：基因组DNA限制酶酶切--- 拼接质粒，导入细菌中保存为文库 部分基因组文库（cDNA文库）：mRNA逆转录得cDNA---拼接质粒，导入细菌中保存为文库 原核细胞 真核细胞 不同点 编码区是连续的 编码区是间隔的、不连续的 相同点 都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成的 （1）原核细胞与真核细胞的基因结构比较 （2） 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小 小 大 基因中启动子 无 有 基因中内含子 无 有 基因多少 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 物种间基因交流 可以 部分基因可以 （3）如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，一定会产生原来的蛋白质吗？为什么？ 不一定 ①原核生物细胞里没有相应的机制来去除内含子； ②原核生物没有真核的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等） 二、基因表达载体的构建 1．基因表达载体构建的目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 2．基因表达载体的组成 3．基因表达载体的构建过程 一般用同种或能产生相同末端的限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处(如图所示)。 1．请区分启动子和终止子与起始密码子和终止密码子：启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分，而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。 2．下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请据图回答下列问题： 限制酶 BamHⅠ HindⅢ EcoRⅠ SmaⅠ 识别序列及切割位点 (1)构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ酶切割质粒？为什么？ 提示　不能；因为SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因。质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。 (2)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？提示　可以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接。 归纳总结　如何选择限制酶 (1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 ②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst Ⅰ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)切割。 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 ①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。 ②质粒作为载体必须具有标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构。 (3)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能表达，即酶切位点应位于启动子与终止子之间。 三、将目的基因导入受体细胞 1．转化的含义 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2．转化的方法：①导入植物细胞：花粉管通道（我国独创的方法）、 农杆菌转化法 ； ②导入动物细胞： 显微注射法 ； ③导入微生物细胞： Ca2+处理法 （使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态）。 (1)导入植物细胞 ①花粉管通道法：可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。受体细胞：一般为受精卵 ②农杆菌转化法：将目的基因导入双子叶植物和裸子植物时最常用的方法。受体细胞：体细胞或受精卵 归纳总结该过程经过 两 次拼接、 两 次导入： ①第一次拼接：将 目的基因 拼接到Ti质粒的 T-DNA上 ②第二次拼接：农杆菌将插入 目的基因的T-DNA 拼接到受体细胞染色体的 DNA上 上（非人工操作） ③第一次导入：将含目的基因的 Ti质粒 重新导入农杆菌④第二次导入：农杆菌将含 目的基因的T-DNA 导入 受体细胞 （非人工操作） a．农杆菌的特点：农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的TDNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 b．方法步骤：目的基因插入Ti质粒的TDNA中→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达。 (2)导入动物细胞 ①方法：显微注射技术。 ②常用受体细胞：受精卵。 (3)导入微生物细胞：常以大肠杆菌作为受体细胞，一般先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。 1．用花粉管通道法导入受体细胞的目的基因是否需要和载体结合？试分析原因。 提示　需要。因为目的基因只有和载体结合成基因表达载体才容易在受体细胞中稳定维持和表达。 2．将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？ 提示　基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，利于重组质粒的导入。 3．植物基因工程常用的受体细胞为什么可以是体细胞，而动物基因工程一般只用受精卵？ 提示　植物体细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程形成完整植物体，因此受体细胞可以是体细胞；动物体细胞的全能性受到严格限制，因此动物基因工程中的受体细胞一般只用受精卵。 4．科学家将外源基因导入绵羊的受精卵中，由于外源基因可能随机插入到受精卵的DNA中，因而有时会导致早期胚胎死亡，请分析可能的原因是什么？ 提示　外源基因的插入可能使受精卵内生命活动必需的某些基因不能正常表达，因而有时会导致早期胚胎死亡。 5．将胰岛素基因的表达载体导入大肠杆菌，从大肠杆菌中获得的“胰岛素”未能达到期待的生物活性，导致这种差异的原因可能是什么？ 提示　大肠杆菌是原核生物，无内质网、高尔基体等细胞器，大肠杆菌中基因表达获得的蛋白质未经加工。 四、目的基因的检测与鉴定 1、目的：检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其 遗传特性 。 2、分子水平的检测： (1)导入水平： ①检测目的：检测受体细胞的 染色体的DNA 上是否插入了 目的基因 。 ②技术手段： PCR 等技术。 (2)转录水平： ①检测目的：检测目的基因是否转录出了 mRNA 。 ②技术手段： PCR 等技术。 (3)翻译水平： ①检测目的：检测目的基因是否 翻译成蛋白质 。 ②技术手段： 抗原-抗体杂交检测 技术。 3、个体水平的鉴定 (1)鉴定目的：检测个体是否具有 相应性状 。 (2)鉴定方法： 抗虫鉴定 （如通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫）、 抗病鉴定 、活性鉴定等。 实验突破(二)　DNA片段的扩增及电泳鉴定 一、实验原理 1．DNA片段的扩增 利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。 2．琼脂糖凝胶电泳 (1)带电粒子：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电荷或负电荷。 (2)迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 (3)迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子本身的大小和构象有关。 (4)检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。 二、方法步骤 1．移液：用微量移液器按照配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组成成分。 2．混合：待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。 3．离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10 s，使反应液集中在管的底部。 4．反应：将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应。 5．根据待分离的DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制合适的琼脂糖凝胶，一般配制质量体积比为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液，并加入适量的核酸染料混匀。 6．将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔。 7．接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5_V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 8．电泳结束后，取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 三、操作提示 1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 3. 该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 4. PCR扩增不能随意加大试剂用量。 四、关键点拨 1．PCR中的解旋过程：PCR过程中不需要(填“需要”或“不需要”)解旋酶，需要通过升高温度打开氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键，因此，DNA加热变性后变为单链，并未分解成单体。 2．PCR需要两种引物，它们分别是能与两条DNA母链的一段碱基序列互补配对的核酸单链。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸，引物自身不能有连续4个碱基的互补序列，两种引物之间不能有连续4个碱基的互补序列。 3．PCR循环之前，常要进行一次预变性，预变性的目的是增加大分子模板DNA彻底变性的概率。 4．判断DNA扩增成功的方法：(1)可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。(2)电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。 第3节　 基因工程的应用 一、基因工程在农牧业方面的应用 1．转基因抗虫植物 (1)方法：从某些生物中分离出具有抗虫功能的基因，将它导入作物中培育出具有抗虫性的作物。 (2)成果：转基因抗虫棉花、玉米、大豆、水稻和马铃薯等。 2．转基因抗病植物 (1)背景：许多栽培作物由于自身缺少抗病基因，因此用常规育种的方法很难培育出抗病新品种。 (2)方法：将来源于某些病毒、真菌等的抗病基因导入植物，培育出转基因抗病植物。 (3)成果：转基因抗病毒甜椒、番木瓜和烟草等。 3．转基因抗除草剂植物 (1)背景：杂草常常危害农业生产，而大多数除草剂不仅能杀死田间杂草，还会损伤作物，导致作物减产。(2)方法：将降解或抵抗某种除草剂的基因导入作物，可以培育出抗除草剂的作物品种。 (3)成果：转基因抗除草剂玉米、大豆、油菜和甜菜等。 4．改良植物的品质 优良基因 成果 必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因 富含赖氨酸的转基因玉米 与植物花青素代谢有关的基因 转基因矮牵牛 5.提高动物的生长速率 (1)基因：外源生长激素基因。 (2)成果：转基因鲤鱼。 6．改善畜产品的品质 (1)基因：肠乳糖酶基因。 (2)成果：转基因牛分泌的乳汁中，乳糖含量大大降低，而其他营养成分不受影响。 1．从环境保护角度出发，分析转基因抗虫棉与普通棉相比在害虫防治方面的优越性。 提示　减少了化学农药的使用量，降低了环境污染。 2．种植转基因抗虫棉若干年后，害虫会不会对转基因抗虫棉产生抗性？为什么？ 提示　会；害虫会因遗传物质发生改变产生对转基因抗虫棉的抗性。 二、基因工程在医药卫生领域的应用 1．利用微生物或动植物细胞生产药物 成果：细胞因子、抗体、疫苗、激素等。 2．利用哺乳动物生产药物 (1)方法：将药用蛋白基因和乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中，由该受精卵发育成的转基因动物在进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物。(2)成果：利用乳腺生物反应器生产抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素、α抗胰蛋白酶等。 3．建立移植器官工厂 人体器官移植的难题：人体移植器官短缺是世界性难题 解决途径：寻求可替代的移植器官，如用猪的器官来解决人类器官移植的来源问题。 猪的优点： a.猪的内脏构造、大小、血管分布与人极为相似 b.猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒远远少于灵长类动物 最大难题：免疫排斥 改造方法： a.在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达； b.设法除去抗原决定基因，然后再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。 1. 1.干扰素的化学本质是什么？干扰素的作用机理是怎样的？ 糖蛋白 干扰病毒复制 2. 传统生产干扰素的方法是什么？ 从人血液中的白细胞内提取 3. 乳腺生物反应器的药用蛋白基因存在于转基因动物的哪些细胞中？ 几乎所有细胞 4. 为什么将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起？ 让药用蛋白基因只在乳腺细胞中特异性表达 5. 研制膀胱生物反应器时，应如何处理目的基因？ 将目的基因与膀胱上皮细胞中特异表达的基因的启动子重组 6. 膀胱生物反应器哪些方面优于乳腺生物反应器？ 不局限于性别与生长期 7. 用生物反应器生产药物的优点？ 产物容易提取 产量高 质量好 成本低 三、基因工程在食品工业方面的应用 1.基因工程菌 概念：用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类。 应用：利用基因工程菌，除了可以生产药物，还能生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。 2.实例 ①阿斯巴甜：一种普遍使用的甜味剂，主要由天冬氨酸和苯丙氨酸形成，这两种氨基酸可通过基因工程实现大规模生产。 ②凝乳酶： 应用：奶酪生产中用来凝聚固化奶中的蛋白质。 传统方法：杀死未断奶的小牛，取出第四胃的黏膜进行提取。 现代制备方法：将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过工业发酵批量生产凝乳酶。 ③淀粉酶、脂酶 应用：加工转化糖浆需要淀粉酶 加工烘烤食品、制造生物能源要用到脂酶 制备方法：构建基因工程菌，然后用发酵技术大量生产。 优点：和天然产物中提取的酶相比，基因工程获得的工业用酶的纯度更高，生产成本显著降低，生产效率较高。 乳腺生物反应器与工程菌生产药物的区别 比较内容 乳腺生物反应器 工程菌 含义 指让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系 基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白质相同 细菌合成的药物蛋白可能没有活性 受体细胞 动物受精卵 微生物细胞 目的基因导入方式 显微注射法 Ga+处理法 生产条件 不需严格灭菌；温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件 第4节　蛋白质工程的原理和应用 1．蛋白质工程 (1)基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。 (2)手段：通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质。 (3)目的：获得满足人类生产和生活需求的蛋白质。 (4)困难：蛋白质发挥功能必须依赖正确的高级结构，而蛋白质的高级结构十分复杂。 2．蛋白质工程崛起的缘由 (1)崛起缘由 ①基因工程的实质：将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状。 ②基因工程的不足：基因工程在原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质。 ③天然蛋白质的不足：天然蛋白质的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。 (2)实例：提高玉米赖氨酸含量 改造后玉米叶片和种子中游离赖氨酸含量分别提高5倍和2倍。 3．蛋白质工程的基本原理 1、目标：根据人们对蛋白质 功能 的特定需求，对蛋白质的 结构 行设计改造。 2、实质：改造或合成 基因 ，来定向改造现有蛋白质，或制造新的蛋白质。 3、基本思路（中心法则的逆推，与天然蛋白质合成的过程相反）： 预期的 蛋白质功能 设计预期的 蛋白质结构 推测应有的 氨基酸序列 找到并改变相对应的 脱氧核苷酸 序列（基因）或合成 新基因 获得所需的蛋白质 4．蛋白质工程的应用 1、医药工业方面 （1）研发速效胰岛素类似物 天然蛋白质易形成二聚体或六聚体 → 预期功能： 抑制 胰岛素的聚合作用→设计结构：改变B链第20～29位氨基酸组成 → 推测序列：B28位脯氨酸替换为__天冬氨酸__或将它与B29位的_赖氨酸_交换位置→改造形成新胰岛素基因 → 转录形成mRNA → 翻译形成多肽链 → 折叠形成___蛋白质（预期结构）___ → 行使功能：有效 抑制 胰岛素的聚合。 （2）延长干扰素体外保存时间 天然干扰素不易保存→预期功能： 延长 保存时间 → 设计结构：氨基酸替换 → 推测序列：一个半胱氨酸变成__丝氨酸___ → 改造形成新干扰素基因 → 转录形成mRNA → 翻译形成多肽链 → 折叠形成_蛋白质（预期结构）_ → 行使功能：在 -70℃ 下可以保存半年。 （3）降低人对小鼠单抗隆抗体的免疫反应 通过__改造基因__，将小鼠抗体上结合__抗原_的区域（即可变区）“嫁接”到人的__抗体__（即恒定区）上，经过这样改造的抗体诱发免疫反应的强度就会_减低_很多。 2、农业方面 （1）_改造__某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用的速率，增加粮食的产量。 （2）利用蛋白质工程的思路设计优良微生物农药，通过改造微生物蛋白质的 结构 ，使它防治病虫害的效果 增强 。 蛋白质工程是一项难度很大的工程，主要是因为蛋白质发挥功能必须依赖于正确的_高级结构__，而这种___高级结构____往往十分复杂。要设计出更加符合__人类需求_的蛋白质，还需要不断地攻坚克难。随着科技的深入发展，蛋白质工程将会给人类带来更多的福祉。 (3)农业方面 ①科学家尝试改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用的效率，增加粮食的产量。 ②科学家利用蛋白质工程的思路设计优良微生物农药，通过改造微生物蛋白质的结构，增强微生物防治病虫害的效果。 1．为什么蛋白质工程需直接改造基因，而不直接改造蛋白质？ (1)任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造的蛋白质也是无法遗传的。 (2)对基因进行改造比对蛋白质直接改造更容易操作，难度要小得多。 2．基因工程和蛋白质工程的区别 (1)通过基因判断：若基因的编码蛋白序列未经改造，则为基因工程，反之，则为蛋白质工程。 (2)通过蛋白质判断：若生产出的蛋白质是天然蛋白质，则为基因工程，反之，则为蛋白质工程。 第2页 共12页 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$