第2讲 基因工程的应用、蛋白质工程和DNA的粗提取-【创新教程】2025年高考生物总复习大一轮教师用书word（人教版 双选）

第2讲　基因工程的应用、蛋白质工程和DNA的粗提取 知识体系——定内容 核心素养——定能力 生命 观念 运用结构与功能观，理解基因工程在农牧、食品以及医药等行业的应用 科学 思维 通过依据人们的要求改造已知蛋白质的基因来获得目标蛋白质的过程，构建蛋白质工程的流程模型 科学 探究 理清DNA的粗提取与鉴定的原理及操作流程 考点1　基因工程的应用和蛋白质工程 [必备知识·整合] 1．基因工程的应用 (1)基因工程在农牧业方面的应用 ①转基因　　抗虫　　植物　②转基因　　抗病　　植物　③转基因　　抗除草剂　　植物　④改良植物的品质　⑤提高动物的　　生长速率　　　⑥改善畜产品的品质 (2)基因工程在医药卫生领域的应用 ①对　　微生物或动植物的细胞　　进行基因改造，使它们生产药物。 ②让哺乳动物批量生产　　药物　　。 ③尝试将建立　　移植器官　　工厂的设想成为现实。 (3)在食品工业方面的应用：利用基因工程菌生产食品工业用酶、　　氨基酸和维生素　　等。 2．蛋白质工程的原理和应用 (1)蛋白质工程的概念 (2)蛋白质工程的基本原理 (3)蛋白质工程的应用 ①医药工业方面：研发药物，如延长干扰素的保存时间；降低小鼠单克隆抗体诱发免疫反应的强度。 ②其他工业方面：改进　　酶　　的性能或开发新的　　工业用酶　　。 ③农业方面：通过改造某些　　参与调控光合作用的酶　　，增加粮食产量；改造微生物　　蛋白质的结构　　，设计优良微生物农药，防治病虫害。 1．转基因抗病农作物不需要使用农药。( × ) 2．利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中。( × ) 3．由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用。( × ) 4．蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质。( √ ) 5．蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构。( × ) 1．(选择性必修3P91“正文”)利用基因工程技术对猪的器官进行改造，采用的方法是在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以　　抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因　　，然后再结合　　克隆　　技术，培育出不会引起　　免疫排斥　　反应的转基因克隆猪器官。 2．(选择性必修3P94“思考·讨论”节选)确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？ 答案：确定目的基因的碱基序列后，可以人工合成目的基因或从基因文库中获取目的基因。对基因的改造经常会用到基因定点突变技术来进行碱基的替换、增添等。 (情景探究)如图为通过基因工程培育抗虫棉的过程，请回答： (1)图示的转化方法是哪一种？其有何特点？ 答案：农杆菌转化法。将目的基因整合到受体细胞染色体上，可稳定遗传。 (2)抗虫棉能抗病毒、细菌和真菌吗？为什么？ 答案：不能。抗虫基因具有专一性。 (3)经上述过程培育的抗虫棉能否取得最后的成功，最简单的检测方法是什么？ 答案：做抗虫实验。 [关键能力·提升] ◆[提升点1]　通过基因工程的应用考查理解能力和获取信息的能力　　 1．(2023·海南高考)基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，我国多个实验室合作开发了一种新型基因递送系统(切—浸—生芽Cut－Dip－Budding，简称CDB法)。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。 回答下列问题。 (1)图1中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于__________；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和____________，该过程还需要光照，其作用是________________________________________________________________________。 (2)图1中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的______。图1中，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标注__________。 (3)图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。 (4)已知某酶(PDS)缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas 9基因编辑载体(含有绿色荧光蛋白标记基因)，利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B。据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是________________________________________________________________________， 图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是________________，依据是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (5)与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点是________________________________________________________________________________________________________________________________________________(答出2点即可)。 解析：(1)题图1中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于脱分化过程，该过程的本质是使细胞失去原来特定的结构和功能；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和细胞分裂素，这两种激素的比值能调控愈伤组织的分化方向，该过程还需要光照，因为叶绿素的形成需要光；且叶绿体利用光能制造有机物，供试管苗生长发育。 (2)图1中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的遗传特性。图1中，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标注转基因种子，即进行转基因标识。 (3)图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，利用了农杆菌含有的Ti质粒的作用，Ti质粒中的T－DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起。 (4)已知某酶(PDS)缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas 9基因编辑载体(含有绿色荧光蛋白标记基因)，利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B，该过程中通过荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根即为阳性毛状根段，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是观察幼苗是否表现出白化特征，因为PDS缺失会导致植株白化，而白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除。 (5)与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点主要表现在操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短。 答案：(1)脱分化　细胞分裂素　诱导叶绿素的形成；满足叶绿体利用光能制造有机物的需要 (2)遗传特性　转基因标识 (3)Ti质粒中的T－DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起 (4)荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根　观察幼苗是否表现出白化特征　PDS缺失会导致植株白化，白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除 (5)操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短。 2．(2024·福建福州模拟)苏云金芽孢杆菌会合成Bt蛋白，在棉铃虫的碱性肠道环境中，Bt蛋白在特定的酶作用下产生毒性，导致棉铃虫死亡。我国科学家利用农杆菌转化法培育转Bt蛋白基因的抗虫棉。下列说法错误的是(　　) A．可根据苏云金杆菌的DNA特定序列设计引物，用PCR技术扩增获得Bt基因 B．需要将Bt基因整合到Ti质粒的T－DNA上，从而构建基因表达载体 C．Bt基因可以整合到棉花染色体上，抗虫棉自交后代不会发生性状分离 D．Bt毒蛋白具有高度专一性，对害虫天敌、人畜均无毒性，在环境中易分解 解析：C　[苏云金芽孢杆菌会合成Bt蛋白，所以可以根据苏云金杆菌的DNA特定序列设计引物，用PCR技术扩增获得Bt基因，A正确；培养抗虫棉需要将Bt基因整合到Ti质粒的T－DNA(可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的DNA)上，B正确；Bt基因可以整合到棉花染色体上，由于只有1条染色体上含有抗虫基因，因此抗虫棉自交后代会发生性状分离，C错误；Bt毒蛋白在特定的酶作用下产生毒性，具有高度专一性，对害虫天敌、人畜均无毒性，其本质是蛋白质，所以在环境中易分解，D正确。] 乳腺生物反应器与工程菌生产药物的区别 比较内容 乳腺生物反应器 工程菌 含义 指将外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类 基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白质相同 细菌合成的药物蛋白可能没有活性 受体细胞 动物受精卵 微生物细胞 目的基因 导入方式 显微注射法 感受态细胞法 生产条件 不需严格灭菌；温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件 药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞或其培养液中提取 ◆[提升点2]　通过蛋白质工程考查识图能力和获取信息能力　　 3．腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域，但不耐高温，利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是(　　) A．N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一 B．加入连接肽需要通过改造基因实现 C．获得N1的过程需要进行转录和翻译 D．检测N1的活性时先将N1与底物充分混合，再置于高温环境 解析：D　[根据题意可知，与N0相比， N1多了一段连接肽，二者氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一，A正确；利用蛋白质工程改造蛋白质时需对相关基因进行修饰或合成，在N0的结构中加入连接肽需要通过改造相关基因来实现，B正确；获得N1的过程需要进行转录和翻译，C正确；检测N1的活性时，需要先将N1与底物置于高温环境下，再将N1与底物充分混合，D错误。] 4．(2023·山东高考)科研人员构建了可表达J­V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有________________________ (答出2个结构即可)。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的________ (填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了______________，条带2所检出的蛋白________ (填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 解析：(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因的转录。质粒作为载体，需要有复制原点、一个至多个限制酶切割位点和便于重组质粒筛选的标记基因等。 (2)用PCR扩增分析法确定重组质粒中目的基因插入方向是否正确时，常设计一对引物，一个引物与目的基因序列互补，另一个引物与质粒序列互补，两引物延伸方向相反，以扩增出两引物间的序列，若插入方向正确，则可扩增出相应序列，反之，则不能扩增出相应序列，故选用的引物应为F2、R1或F1、R2，若选用引物F1、R1，不论目的基因插入方向是否正确，都可扩增出目的基因序列。因为J基因的b链为转录的模板链，启动子在左侧，所以转录方向为从左到右，由于转录沿模板链3′到5′端方向合成RNA，所以J基因b链左侧为3′端，引物要与DNA的3′端互补配对，所以F1与b链互补，a链也与b链互补，由此推知引物F1与a链相应部分序列相同。 (3)抗J蛋白抗体和抗V5抗体均能检测到条带1，说明条带1为J­V5融合蛋白，条带2仅能由抗J蛋白抗体检测到，说明该蛋白仅含J蛋白，不含V5标签，故条带2检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。 答案：(1)RNA聚合酶　标记基因、复制原点(或限制性酶切割位点) (2)F2和R1(或“F1和R2”)　a链 (3)J­V5融合蛋白　不是 蛋白质工程与基因工程的区别和联系 探究实践十七　DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定　对应学生P335 1．DNA的粗提取与鉴定 (2)实验步骤 2．DNA 片段的扩增及电泳鉴定 (1)实验原理 ①PCR原理：利用了　　DNA的热变性　　原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 ②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷　　相反　　的电极移动，这个过程就是电泳。 ③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的　　大小和构象　　等有关。 (2)实验步骤 (3)DNA的测定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为　　300_nm　　的紫外灯下被检测出来。 1．DNA粗提取实验中过滤能否用滤纸代替纱布？ 答案：不可以。因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。 2．DNA的电泳鉴定实验中，影响DNA分子迁移速率的因素有哪些？ 答案：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 1．(2021·山东高考)粗提取 DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是(　　) A．加入适量的木瓜蛋白酶 B．37～40 ℃的水浴箱中保温 10～15 分钟 C．加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精 D．加入 NaCl 调节浓度至 2 mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0.14 mol/L 解析：A　[木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解DNA，过滤后在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物，A正确；37～40 ℃的水浴箱中保温 10～15 分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在60～75 ℃的水浴箱中保温 10～15 分钟，使蛋白质变性析出，B错误；向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中，C错误；加入 NaCl 调节浓度至 2 mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0.14 mol/L，DNA在0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度小，DNA析出，不会进入滤液中，D错误。] 2．人体内一些正常或异常细胞脱落破碎后，其DNA会以游离的形式存在于血液中，称为cfDNA。近几年，结合PCR及电泳鉴定、DNA测序等技术，cfDNA在临床上得到了广泛应用。下列相关说法不正确的是(　　) A．PCR反应中设置不同的温度是为了使DNA聚合酶催化不同的反应 B．在琼脂糖凝胶中，cfDNA的迁移速率与cfDNA分子的大小、构象等有关 C．在进行电泳时，要预留一个加样孔，加入指示分子大小的标准参照物 D．对cfDNA进行检测，可以用于肿瘤的早期筛查 解析：A　[PCR反应中温度的周期性改变是为了解旋变性、复性、延伸，A错误；分子的大小、形态、凝胶的种类、密度，电泳的电压大小等都会影响分子迁移速率，B正确；在进行电泳时，要预留一个加样孔，加入指示分子大小的标准参照物，C正确；cfDNA是人体内一些正常或异常细胞脱落破碎后形成的游离DNA，所以可通过检测cfDNA中的相关基因，判断其来自正常或异常细胞，并进行癌症的筛查，D正确。] 3．(2024·河北沧州高三联考)DNA标记是DNA或基因中一些稳定的特征性碱基序列，通过相应DNA标记PCR扩增产物的电泳图谱可进行遗传病致病基因的定位。如图为某家庭中甲、乙两种遗传病相关基因(包含正常基因和致病基因)的电泳图，该家庭中父母均不患乙病，儿子同时患甲、乙两种病，不考虑X、Y染色体同源区段。下列叙述错误的是(　　) A．PCR扩增需要知道基因中全部的特征性碱基序列 B．甲病基因位于常染色体上，乙病基因位于X染色体上 C．若该家庭再生一个女儿，患病的概率为100% D．遗传咨询和产前诊断能在一定程度上预防甲、乙病 解析：A　[已知基因中两端的部分特征性碱基序列，即可设计合适的引物，对其进行PCR扩增，A错误；由题图可知，父亲关于甲病的电泳条带只有150 bp一种类型，说明其为纯合子，母亲关于甲病的电泳条带只有300 bp一种类型，说明其是与父亲基因型不同的纯合子，儿子关于甲病的电泳条带包含150 bp和300 bp两种类型，说明其甲病有关的基因来自父亲和母亲，即为杂合子，则甲病为常染色体显性遗传病；父亲关于乙病的电泳条带只有250 bp一种类型，母亲关于乙病的电泳条带有250 bp和100 bp两种类型，儿子只含有100 bp一种类型，说明儿子关于乙病的基因只来自母亲，且该家庭中父母均不患乙病，因此乙病为伴X染色体隐性遗传病，B正确；甲病为常染色体显性遗传病，母亲和父亲都是纯合子，而且二者基因型不同，即一方为显性纯合子，另一方为隐性纯合子，故该家庭再生一个孩子一定会患甲病，C正确；通过遗传咨询和产前诊断等手段，可以对遗传病进行检测和预防，D正确。] 4．某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动，具体步骤如下： 材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份，每份10 g，剪碎后分成两组，一组置于20 ℃条件下、另一组置于－20 ℃条件下，分别保存24 h。 DNA的粗提取： 第一步：将上述材料分别放入研钵中，各加入15 mL研磨液，充分研磨。用两层纱布过滤，取滤液备用。 第二步：先向6只小烧杯中分别注入10 mL滤液，再加入20 mL体积分数为95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。 第三步：取6支试管，分别加入等量的2 mol·L－1的NaCl溶液溶解上述絮状物。 DNA的鉴定：在上述试管中各加入4 mL二苯胺试剂，混合均匀后，置于沸水中加热5 min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅，结果如下表。 材料保存温度 花菜 辣椒 蒜黄 20 ℃ ＋＋ ＋ ＋＋＋ －20 ℃ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋ 注：“＋”越多表示蓝色越深 分析上述实验过程，回答下列问题： (1)该探究性实验的课题名称是　_____________________________________________。 (2)第二步中“缓缓地”搅拌，这是为了减少__________________________________。 (3)根据实验结果，得出结论并分析。 ①结论1：与20 ℃相比，相同实验材料在－20 ℃条件下保存，DNA的提取量较多。 结论2： __________________________________________________________________。 ②针对结论1，请提出合理的解释：______________________________________________ ________________________________________________________________________________________________。 (4)氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，且对DNA影响极小。为了进一步提高DNA纯度，依据氯仿的特性，在DNA粗提取第三步的基础上继续操作的步骤是___________________________________________________________，然后用体积分数为95%的冷酒精溶液使DNA析出。 解析：(1)从表格可以看出，该实验有两个自变量：材料和温度，所以该探究性实验的课题名称为“探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响”。低温抑制了相关酶的活性，DNA降解速度慢，提取的DNA量较多。 (2)第二步中用玻璃棒搅拌的目的是获取DNA絮状物，所以若搅拌速度快，易造成DNA断裂。 (3)本实验的结论可从两个方面来考虑：①相同材料在不同保存温度下的结论；②不同材料在相同保存温度下的结论。 (4)氯仿能使蛋白质变性沉淀，而对DNA影响极小，所以可将第三步获得的溶液与氯仿混合，又因氯仿密度大于水，所以蛋白质沉淀位于溶液下部，DNA位于上清液中。 答案：(1)探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响　(2)DNA断裂　(3)①等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄中提取的DNA量最多　②低温抑制了相关酶的活性，DNA降解速度慢　(4)将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混合，静置一段时间，吸取上清液 教师用书独具 [易错点1]　误认为“蛋白质工程”是针对蛋白质进行操作的 点拨　“蛋白质工程”是第二代基因工程。合成的蛋白质是自然界中没有的，是按照人的意愿合成的。不过蛋白质工程的操作对象是基因，通过改变基因来改造蛋白质。 [易错点2]　比较“蛋白质工程”和“基因工程”区别 点拨 　 蛋白质工程 基因工程 过 程 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新基因→获得所需要的蛋白质 目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 实 质 定向改造生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的类型或生物产品 结 果 可生产自然界没有的蛋白质 只能生产自然界已有的蛋白质 1.基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质。 2．对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成。 3．利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白。 4．DNA粗提取实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核。 5．DNA片段在凝胶中电泳时的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 [真题研析]——浸润素养 [例](2023·天津高考)基因工程：制备新型酵母菌 (1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需的多种酶，推测这些酶生效的场所应该是____________ (填“细胞内”和“细胞外”) (2)同源切割是一种代替限制酶、DNA连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员运用同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A、B，已知酵母菌体内DNA有许多A－B序列位点可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物__________对目的基因进行PCR。 (3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因(UGA)常用作标记基因，又知尿嘧啶可以使5－氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质。 (i)导入目的基因的酵母菌应在____________的培养基上筛选培养。由于需要导入多种酶基因，需要多次筛选，因此在导入一种目的基因后，要切除UGA基因，再重新导入。研究人员在UGA基因序列两端加上酵母菌DNA中不存在的同源C、C′序列，以便对UGA基因进行切除。C、C′的序列方向将影响切割时同源序列的配对方式，进而决定DNA片段在切割后是否可以顺利重连，如图，则应选择方式____________进行连接。 (ii)切去UGA基因的酵母菌应在____________的培养基上筛选培养。 (4)综上，目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该如图____________。 解析：(1)由于酵母菌不能吸收淀粉，所以导入分解淀粉的酶发挥作用的场所在细胞外。 (2)根据题干信息“当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入”，要保证目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同，需要选择P1和P6这对引物进行PCR。 (3)(i)选择了尿嘧啶合成基因(UGA)用作标记基因，则应该将酵母菌放在缺乏尿嘧啶的培养基上培养，如果导入成功，则形成菌落；如果没有导入，则缺乏尿嘧啶，不能生存； 方式1，C和C′方向相反，如果切割，则末端在一条链上，不能连接，所以选择方式2，连接方向相同，切割后形成末端，便于连接。 (ii)由于尿嘧啶可以使5－氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质，所以应该在含有5－氟乳清酸的培养基上，如果切割成功，则不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，则会产生有毒物质，不能形成菌落。 (4)根据前面分析，C和C′的中间插入UGA，A和B之间插入的目的基因，所以图3正确。 答案：(1)细胞外　(2)P1和P6 (3)缺乏尿嘧啶　方式2　含有5－氟乳清酸 (4)图3 [信息破题] 信息 信息转化能力 信息1 同源切割是一种代替限制酶、DNA连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法 信息2 尿嘧啶可以使5－氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质 [考向分析]　教师用书独具 23年已考考向 未考考向 1.基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用 1.DNA的粗提取与鉴定的方法 2.蛋白质工程原理及操作流程 2.蛋白质工程的应用及实例分析 [真题品悟]——厚积素养 [考向]　DNA的粗提取及鉴定的方法　　 (2022·山东高考)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是(　　) A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质 解析：B　[低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一块儿析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。] [真题变式]——迁移能力 (2023·辽宁高考)天然β－淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造β－淀粉酶基因，并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β－淀粉酶。回答下列问题： (1)上述过程属于______工程。 (2)PCR中使用的聚合酶属于______ (填写编号)。 ①以DNA为模板的RNA聚合酶 ②以RNA为模板的RNA聚合酶 ③以DNA为模板的DNA聚合酶 ④以RNA为模板的DNA聚合酶 (3)某天然β－淀粉酶由484个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明显提升。在图1所示的β－淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是______ (填写编号)。 (4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2所示的pLN23质粒构建得到基因表达载体。除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因(即改造后的基因)和______。 (5)目的基因(不含EcoR Ⅰ酶切位点)全长为1.5 kb，将其插入BamHⅠ位点。用EcoR Ⅰ酶切来自于不同大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是_____。正确连接的基因表达载体被EcoRⅠ酶切后长度为_____kb。 (6)采用PCR还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过_____反应获得PCR的模板。 解析：(1)根据蛋白质的功能改变基因的结构，最终获得耐高温的β－淀粉酶，这属于蛋白质工程。 (2)PCR的原理是DNA双链复制，利用的酶是耐热的DNA聚合酶，合成子链时是以DNA为模板。 (3)根据β－淀粉酶的编码序列，替换的碱基在编码序列中，则利用的引物应该把编码序列全部扩增在内，则所用的引物是②③。 (4)作为基因工程载体的质粒应该包含：复制原点、限制酶的切割位点、标记基因、启动子和终止子，根据图示的表达载体可知应还要包括目的基因和标记基因。 (5)目的基因通过表达载体导入大肠杆菌中，大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是筛选出导入目的基因的大肠杆菌。正确连接的基因表达载体只有一个EcoRⅠ酶切位点，则切割后的长度为4.2＋1.5＝5.7 kb。 (6)转录是以DNA为模板合成RNA的过程，通过PCR在分子水平上确定目的基因是否转录，则需要以RNA为模板逆转录出DNA作为PCR反应的模板。 答案(1)蛋白质 (2)③ (3)②③ (4)标记基因 (5)筛选导入目的基因的大肠杆菌　5.7 (6)逆转录 ►[改形式] (2023·辽宁高考)CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起(如下图)，使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去(　　) A．CD163基因中编码起始密码子的序列 B．CD163基因中编码终止密码子的序列 C．RFP基因中编码起始密码子的序列 D．RFP基因中编码终止密码子的序列 解析：B　[为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，则拼接在一起的红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因都得转录和翻译，使其表达成一条多肽，因此拼接在一起的CD163基因转录形成的mRNA中不能出现终止密码子，否则红色荧光蛋白RFP基因转录形成的mRNA不能进行翻译，无法合成红色荧光蛋白，因此该拼接过程的关键步骤是除去CD163基因中编码终止密码子的序列，B符合题意，ACD不符合题意。] 学科网（北京）股份有限公司 $$