第1讲 基因工程的基本工具和操作程序-【创新教程】2025年高考生物总复习大一轮教师用书word（人教版 双选）

第1讲　基因工程的基本工具和操作程序 知识体系——定内容 核心素养——定能力 生命 观念 运用结构与功能观，理解基因工程的原理和技术 科学 思维 从基因工程诞生的历程中，体会科学发展的曲折性和必然性 科学 探究 尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物 考点1　基因工程的基本工具 [必备知识·整合] 1．基因工程的概念 (1)手段：按照　　人们的愿望　　，通过　　转基因　　等技术，赋予生物新的遗传特性。 (2)目的：创造出更符合人们需要的新的　　生物类型　　和　　生物产品　　。 (3)水平：　　分子　　水平。 (4)基础：　　生物化学　　、分子生物学和　　微生物学　　等学科。 2．基因工程的基本工具 (1)　　限制性内切核酸酶　　——“分子手术刀” (2)DNA连接酶——“分子缝合针” (3)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” ①作用：将　　外源基因　　送入受体细胞中。 ②种类：　　质粒　　、噬菌体和　　动植物病毒　　等。 ③条件： a．具有一个至多个　　限制酶切割位点　　，供外源DNA插入其中。 b．能在受体细胞中进行　　自我复制　　，或整合到受体DNA上，随受体DNA　　同步复制　　。 c．具有　　标记基因　　，便于重组DNA分子的筛选。 1．切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。( × ) 2．限制酶也可以识别和切割RNA。( × ) 3．DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来。( × ) 4．E.coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。( × ) 5．载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因。( × ) 1．(选择性必修3P74“拓展应用1”)限制酶为什么不切割细菌本身的DNA分子？ 答案：因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 2．(选择性必修3P72“正文”)天然的DNA分子是否可以直接用做基因工程载体？为什么？ 答案：不可以。具有能自我复制、有一个或多个限制酶切割位点、有标记基因及对受体细胞无害等特点的DNA分子才可以直接用作基因工程的载体。实际上天然的DNA分子一般不完全具备上述条件，往往需要进行人工改造后才能用于基因工程操作。 (情景探究)如图表示目的基因两侧和载体上的限制酶切割位点，据图分析： (1)如图选择限制酶时，选择Pst Ⅰ，而不选择Sma Ⅰ 的原因是什么？ 答案：选择限制酶时，不能选择酶切位点位于目的基因内部或标记基因内部的限制酶。 (2)为了避免目的基因和质粒自身环化、反向连接，应该如何选择限制酶？ 答案：选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 (3)切割目的基因和质粒的限制酶是否一定为同一种限制酶？ 答案：不一定，只要切出的黏性末端相同即可。 [关键能力·提升] ◆[提升点1]　通过基因工程的概念考查理解能力　　 1．(2024·黑龙江高三质检)下列关于基因工程的叙述，错误的是(　　) A．基因工程是在分子水平上对生物进行遗传改造 B．基因工程的发展独立于生命科学基础理论的发展 C．基因工程已经广泛应用于医学、农业、工业、环境保护等领域 D．基因工程可创造出更符合人们需要的新的生物类型和产品 解析：B　[基因工程是在DNA分子水平上对生物进行的遗传改造，以获得人们需要的新的生物类型和生物产品，A正确；基因工程的发展离不开生命科学基础理论的支持，B错误；基因工程的应用非常广泛，已经用于医学、农业、工业、环境保护等领域，C正确；基因工程是在分子水平开展生命科学研究，通过定向改造生物的遗传物质，创造出更符合人们需要的新的生物类型和产品，D正确。] 基因工程的理论基础 ◆[提升点2]　通过基因工程的工具酶考查识图分析能力和信息获取能力　　 2．用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是(　　) A．如图中两种酶识别的核苷酸序列不同 B．如图中酶切产物可用于构建重组DNA C．泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物 D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA 解析：D　[限制酶识别特定的脱氧核苷酸序列，不同的限制酶能识别不同的核苷酸序列，由电泳图可知XhoⅠ和SalⅠ两种酶分别切割时，识别的序列不同，A正确；同种限制酶切割出的DNA片段，具有相同的黏性末端，再用DNA连接酶进行连接，可以构成重组DNA，B正确；SalⅠ将DNA片段切成4段，XhoⅠ将DNA片段切成3段，根据电泳结果可知泳道①为SalⅠ，泳道②为XhoⅠ，C正确；限制酶切割双链DNA，酶切后的DNA片段仍然是双链DNA，D错误，所以选D。] 3．下列与生物工程中有关的酶的说法，正确的是(　　) A．胰蛋白酶和胃蛋白酶都能用于制备细胞悬液 B．限制性内切核酸酶和解旋酶都作用于氢键 C．逆转录酶和DNA连接酶发挥作用时都需要模板 D．DNA聚合酶和RNA聚合酶都能催化磷酸二酯键的形成 解析：D　[胃蛋白酶最适pH为酸性，不适宜用于制备细胞悬液，A错误；限制性内切核酸酶作用于磷酸二酯键，B错误；DNA连接酶发挥作用时不需要模板，C错误；RNA聚合酶和DNA聚合酶都是催化核苷酸之间连接形成磷酸二酯键，D正确。] 与DNA有关的几种酶的比较 ◆[提升点3]　通过基因工程的工具——载体考查综合分析能力和获取信息能力　　 4．某研究所的研究人员拟将生长激素基因通过质粒介导进入大肠杆菌细胞内，已知质粒中存在两个抗性基因：A是抗链霉素基因，B是抗氨苄青霉素基因，目的基因要插入到基因B中，且大肠杆菌本身不带有任何抗性基因。下列叙述正确的是(　　) A．导入大肠杆菌的质粒一定为重组质粒 B．抗生素抗性基因是目的基因表达的必要条件 C．成功导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基上生长 D．能在含链霉素的培养基中生长的大肠杆菌不一定符合生产要求 解析：D　[导入大肠杆菌的质粒可能为重组质粒，也可能为普通质粒，A错误；抗生素抗性基因是标记基因，是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，与目的基因表达无关，B错误；由于目的基因要插入到基因B中，即抗氨苄青霉素基因被破坏，即工程菌不能抗氨苄青霉素，因此成功导入重组质粒的大肠杆菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，C错误；能在含链霉素的培养基中生长的大肠杆菌可能含有重组质粒或普通质粒，因此不一定符合生产要求，D正确。] 5．某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH Ⅰ酶切割后，与用BamH Ⅰ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题： (1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_________ (答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。 (2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是__________________________________；并且_________和____________________的细胞也是不能区分的，其原因是_______________________________________________。 在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有______________的固体培养基。 (3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于________________。 解析：(1)质粒作为载体，应具备的基本条件有：有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中；在受体细胞中能自我复制，或能整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制；有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择等。 (2)在培养基中加入氨苄青霉素进行筛选，其中未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌，因不含氨苄青霉素抗性基因而都不能在此培养基上存活，二者不能区分。含有质粒载体的大肠杆菌和含有插入了目的基因的质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，都能在此培养基上存活，二者也不能区分。若要将含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌进一步筛选出来，还需要使用含有四环素的固体培养基。 (3)某些噬菌体经改造后作为载体，导入受体细胞后，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。 答案：(1)能自我复制、具有标记基因(答出两点即可)　(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长　含有质粒载体　含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)　二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长　四环素　(3)受体细胞 标记基因的作用 标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞： 考点2　基因工程的基本操作程序 [必备知识·整合] 1．目的基因的筛选与获取 (1)筛选合适的目的基因 ①目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变　　受体细胞性状　　或获得　　预期表达产物　　等的基因。主要是指　　编码蛋白质　　的基因。 ②筛选目的基因的方法：从相关的已知　　结构和功能　　清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 (2)利用PCR获取和扩增目的基因 ①原理：　　DNA复制　　。 ②条件：DNA模板、2种引物、　　耐高温的DNA聚合酶　　和4种脱氧核苷酸。 ③扩增过程 过程 说明 图解 变 性 温度上升到90 ℃以上，双链DNA解聚为单链 复 性 温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对原则与两条单链DNA结合 延 伸 温度上升到72 ℃左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 2.基因表达载体的构建 (1)构建基因表达载体的目的 ①使目的基因在受体细胞中　　稳定存在　　，并且可以　　遗传　　给下一代。 ②使目的基因能够　　表达　　和发挥作用。 (2)基因表达载体的组成 (3)基因表达载体的构建过程 3．将目的基因导入受体细胞 类型 方法 说明 特点 植 物 细 胞 花粉管 通道法 用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入　　子房　　中；在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在　　花柱切面　　上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 简便、经济，我国科学家独创的一种方法 农杆菌 转化法 将目的基因插入到农杆菌Ti质粒的　　T－DNA　　上→转入农杆菌→用农杆菌侵染植物细胞→将目的基因整合到植物细胞的　　染色体DNA　　上→目的基因表达 经济、有效，适用于双子叶植物和裸子植物，尤其适用于双子叶植物，但单子叶植物也获得了成功 动 物 细 胞 显微注 射技术 将含有目的基因的　　表达载体提纯　　→取卵(受精卵)→显微注射→注射了目的基因的受精卵，经　　胚胎早期培养　　后，移植到雌性动物的输卵管或子宫内→获得具有新性状的动物 将目的基因导入动物细胞最为有效的方法 微 生 物 细 胞 Ca2＋ 处理法 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的　　生理状态　　→基因表达载体导入 简便、经济、有效 4.目的基因的检测与鉴定 检测水平 检测目的 检测方法 分子水平 目的基因是否插入到转基因生物染色体DNA上 PCR　　技术 目的基因是否转录出了mRNA 目的基因是否翻译出蛋白质 　抗原—抗　　 体杂交 个体水平 转基因生物是否表现出相应的特性　　　 如抗虫、抗病的接种实验 1．目的基因就是指编码蛋白质的基因。( × ) 2．用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物。( √ ) 3．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。( √ ) 4．抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体DNA上也未必能正常表达。( √ ) 5．应用PCR技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完成表达。( × ) 1．(选择性必修3P77“相关信息”改编)Bt抗虫蛋白造成害虫死亡的原因是什么？ 答案：当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。 2．(选择性必修3P79“旁栏思考”)PCR可以扩增mRNA吗？ 答案：不可以。因为PCR是用DNA双链做模板的，不能直接用单链RNA做PCR，必须把mRNA逆转录成单链cDNA之后再做PCR。 (情景探究)如图表示将目的基因插入含有两种标记基因的载体后，并选出含目的基因的受体细胞的过程，请回答： (1)图中的标记基因是哪一个，你是如何确定的？ 答案：是氨苄青霉素抗性基因。目的基因插入四环素抗性基因内部，使四环素抗性基因失活。 (2)被转化的细菌有哪三种？ 答案：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。 (3)图示筛选含目的基因细菌的方法是怎样的？ 答案：先将混合细菌接种到含氨苄青霉素的培养基上，能生长的是含重组质粒的和含自身环化质粒的细菌；再用影印法接种到含四环素的培养基上，不能生长的是含目的基因的菌落，最后从含氨苄青霉素的培养基上挑取相应菌落进行培养即可。 [关键能力·提升] ◆[提升点1]　通过PCR扩增的过程考查理解能力、思维判断能力　　 1．PCR是一种体外扩增DNA的技术，模拟了体内的DNA复制过程。如图为PCR技术原理示意图，对于图中物质和过程的说明，错误的是(　　) A．物质a：游离的脱氧核苷酸 B．过程①：氢键断裂 C．过程②：边解旋边复制 D．过程③：严格遵循碱基互补配对原则 解析：C　[PCR模拟了体内的DNA复制，所以a是DNA复制的原料——脱氧核苷酸，A正确；在94 ℃高温条件下，DNA分子双螺旋解开，形成单链，此时氢键断裂，B正确；体外模拟DNA的复制依据了DNA的热变性原理，该过程DNA分子不是边解旋边复制，C错误；DNA复制需要严格遵循碱基互补配对原则，D正确。] 2．(不定项)不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA的方法。这两种引物分别为限制性引物与非限制性引物，其最佳比例一般为1∶50－1∶100，在PCR反应的最初10－15个循环中，其扩增产物最初主要是双链DNA，但当限制性引物消耗完后，非限制性引物引导的PCR就会产生大量的单链DNA。下列相关说法错误的是(　　) A．不能利用不对称PCR 来制备探针 B．复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物 C．用不对称PCR方法扩增目的基因时需知道基因的全部序列 D．因为双链DNA和单链DNA的分子量大小不同，可通过电泳方法将其分离 解析：AC　[探针也是单链DNA，根据题意可知不对称PCR可用来合成大量的单链DNA，A错误；复性温度过高会导致引物无法与模板结合，从而无扩增产物形成，B正确；PCR时不需要知道扩增基因的全部序列，只需要知道两端的部分序列即可，C错误；单链DNA和双链DNA的分子量不同，电泳可以将其分离，D正确。] PCR扩增的注意事项 (1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 (2)引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。 (3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。 (4)PCR的扩增结果：DNA分子以指数形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环次数) ◆[提升点2]　通过目的基因导入和基因表达载体构建考查科学思维能力　　 3．下列关于目的基因导入受体细胞的叙述，不正确的是(　　) A．花粉管通道法的操作之一是用微量注射器将含有目的基因的溶液直接注入子房中 B．显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法 C．大肠杆菌最常用的转化方法是：使细胞的生理状态发生改变 D．农杆菌转化法是我国科学家独创的一种方法 解析：D　[花粉管通道法的操作之一是用微量注射器将含有目的基因的溶液直接注入子房中，A正确；目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射技术，B正确；大肠杆菌细胞最常用的转化方法是用Ca2＋处理细胞，使细胞的生理状态发生改变，从而完成转化过程，C正确；我国科学家独创的方法是花粉管通道法，D错误。] 4．(不定项)如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法正确的是(　　) A．图示过程是基因工程的核心步骤 B．表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ C．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来 D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构 解析：ACD　[图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤，A正确；构建过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，B错误；抗卡那霉素基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞，C正确；基因表达载体包括复制原点、启动子、目的基因、终止子和标记基因等，D正确。] 图解限制酶的选择原则 ①不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 ②保留标记基因原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 ③确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 ◆[提升点3]　通过基因工程的操作过程考查科学思维能力　　 5．为提高红豆杉细胞培养物中紫杉醇的产量，研究人员构建紫杉醇合成关键酶基因(Bapt)的超表达载体，并将其导入红豆杉细胞，具体流程如图所示。下列相关说法不正确的是(　　) A．p1301载体上应含有增强Bapt基因表达的序列 B．超表达载体中应含有潮霉素抗性基因作为标记基因 C．可使用Bapt基因制成的探针检测过程⑤是否成功 D．工厂化生产紫杉醇需将改造后的红豆杉细胞培养至愈伤组织 解析：C　[根据题干推测，p1301载体上可能含有增强Bapt基因表达的序列，A正确；超表达载体中应含有潮霉素抗性基因作为标记基因，在含有潮霉素的培养基上，超表达载体能够存活，从而起到筛选作用，B正确；由于红豆杉细胞中本身存在Bapt基因，无论超表达载体是否成功导入，都能与Bapt基因探针形成杂交分子，因此不能通过Bapt基因探针来检测步骤⑤是否成功，C错误；工厂化生产紫杉醇属于细胞产物的获得，只需要培养到愈伤组织阶段即可，D正确。] 6．(2022·河北高考)蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂(NaPI)和胰凝乳蛋白酶抑制剂(StPinlA)的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。回答下列问题： (1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是__________。 (2) ____________是实施基因工程的核心。 (3)利用农杆菌转化法时，必须将目的基因插入到质粒的__________上，此方法的不足之处是__________。 (4)为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译，可采用的检测技术有__________ (写出两点即可)。 (5)确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的________以鉴定其抗性程度。下图为三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果，据结果分析________ (填“NaPI”或“StPinlA”或“NaPI＋StPinlA”)转基因棉花的抗虫效果最佳，其原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。 (6)基因突变可产生新的等位基因，在自然选择的作用下，昆虫种群的基因频率会发生__________，导致昆虫朝着一定的方向不断进化。据此推测，胰蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后，某些害虫具有了抗胰蛋白酶抑制剂的能力，其分子机制可能是________ (写出两点即可)。 解析：(1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物达到抗虫的目的。 (2)基因工程的核心是基因表达载体的构建。 (3)农杆菌转化法的原理：农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。其不足之处是该方法不适用于单子叶植物。 (4)目的基因是否整合的检测，在分子水平上可通过检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因、是否能转录出目的基因对应的mRNA、是否能合成目的基因所控制合成的蛋白质等，即可利用PCR技术、抗原－抗体杂交技术等。 (5)抗虫鉴定：确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的接种实验以鉴定其抗性程度。由题图可知，NaPI转基因棉花的抗虫效果最佳，因为饲喂NaPI转基因的虫体质量较对照组差，且每株棉铃虫数较对照组少。 (6)在自然选择的作用下，种群的基因频率会发生定向改变，导致生物朝一定方向不断进化。由于害虫发生基因突变后，在胰蛋白酶抑制剂的选择下，抗性基因频率逐渐增高，从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力，或胰蛋白酶抑制剂基因发生突变后不能编码出胰蛋白酶抑制剂。 答案：(1)调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物达到抗虫的目的 (2)基因表达载体的构建(表达载体的构建) (3)T－DNA　该方法不适用于单子叶植物 (4)PCR技术、抗原－抗体杂交技术 (5)接种实验　NaPI　饲喂NaPI转基因的虫体质量较对照组差，且每株棉铃虫数较对照组少 (6)定向改变　由于害虫发生基因突变后，在胰蛋白酶抑制剂的选择下，抗性基因频率逐渐增高，从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力，或胰蛋白酶抑制剂基因发生突变后不能编码出胰蛋白酶抑制剂 目的基因的检测与鉴定 教师用书独具 [易错点1]　不能正确区分细胞膜上的载体和基因工程的载体 点拨　细胞膜上的载体是蛋白质；基因工程中的载体可能是λ质粒，也可能是生物，如噬菌体、动植物病毒等。 [易错点2]　误认为PCR复性时，只有引物与DNA模板结合　 点拨　复性时，除了引物与DNA模板结合外，还存在DNA解开的两条链的结合。 [易错点3]　误认为PCR反应的结果都是所需的DNA片段 点拨　第一次循环得到的DNA片段只有一种引物，比所需的DNA片段要长，从第二次循环才出现所需的DNA片段。 1.切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别各自特定的核苷酸序列。 2．质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体。 3．基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 4．用PCR方法扩增目的基因时要经过变性、复性、延伸三个环节。 5．基因工程的基本过程包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 6．应用DNA探针技术，可以检测目的基因是否已经导入细胞、导入的目的基因是否转录成功。检测蛋白质要用抗原－抗体杂交技术。 [真题研析]——浸润素养 [例](2023·重庆高考)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(下图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是(　　) A．其中一个引物序列为5′TGCGCAGT－3′ B．步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段 D．酶切片段和载体连接时，可使用E.coli DNA连接酶或T4连接酶 解析：B　[由于引物只能引导子链从5′到3′，根据碱基互补配对原则，其中一个引物序列为5′TGCGCAGT－3′，A正确；根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用NheⅠ切割形成的，右边的黏性末端是用CfoⅠ切割形成的，B错误；用步骤①的酶对载体进行酶切，使用了NheⅠ和CfoⅠ进行切割，根据他们的识别位点以及原本DNA的序列，切割之后至少获得了2个片段，C正确；图中形成的是黏性末端，而E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端；T4 DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端，D正确。] [信息破题] 信息 信息获取能力 信息1 用限制酶进行酶切 信息2 成功构建了基因表达载体 [考向分析]　教师用书独具 23年已考考向 未考考向 1.PCR扩增的原理及过程 1.转基因的基本工具 2.基因表达载体的构建 2.目的基因的获取 3.将目的基因导入受体细胞 3.目的基因的检测与鉴定 [真题品悟]——厚积素养 [考向]　基因表达载体的构建　　 (2023·湖北高考)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 解析：D　[若用Hind Ⅲ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确。若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。] [真题变式]——迁移能力 (2022·河北高考)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3－GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。 下列叙述正确的是(　　) A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3－GFP基因纯合子 D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 解析：B　[分析题图可知，启动子在左侧，GFP基因整合Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GEP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误；因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3－GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误；用引物1和引物3进行PCR扩增，只能扩增出Gata3­GFP基因，不能扩增出Gata3基因，因此不能区分杂合子和纯合子。] ►[新情景] (2023·江苏高考)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题。 (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有______，扩增程序中最主要的不同是________。 (2)有关基因序列如图2。引物F2－F、F1－R应在下列选项中选用______。 A．ATGGTG－－－－－－CAACCA B．TGGTTG－－－－－－CACCAT C．GACGAG－－－－－－CTGCAG D．CTGCAG－－－－－－CTCGTC′ (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有________。 (4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有________。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 (5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3.根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有______。 (6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。 解析：(1)PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2＋)。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时， 配制的两个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段F2)、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合。片段F1与片段F2大小不同，因此扩增程序中最主要的不同是延伸时间的不同。 (2)由图1可知，引物F2－F与EGFP 5′端到3′端碱基序列右侧加上AnB1 5′端到3′端碱基序列左侧相同，所以引物F2－F选用C同理，引物F1－R与EGFP 5′端到3′端碱基序列右侧加上AnB1 5′端到3′端碱基序列左侧互补，因此引物F1－R选用D。 (3)传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，由于PCR产物片段和线性质粒载体具有同源序列，可通过重组酶形成环化质粒。不需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)和DNA连接酶。 (4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，菌落数可能低于30，A错误；培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B错误；转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。故选ABC。 (5)EGFP为720 bp，AnB1为390 bp，二者的总大小为720 bp＋390 bp＝1 100 bp，用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。 (6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。 答案：(1)模板(片段F1、片段F2)、引物　延伸时间 (2)CD (3)限制性内切核酸酶(限制酶)、DNA连接酶 (4)ABC (5)P3、P4 (6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列 学科网（北京）股份有限公司 $$