备课素材：cDNA文库的构建 2023—2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3

cDNA文库的构建 先看一道试题： 利用人胰岛B细胞构建cDNA文库，然后通过核酸分子杂交技术从中筛选目的基因，筛选过程如图所示。下列说法错误的是（　　） A. cDNA 文库的构建需要用到逆转录酶  B. 图中的菌落是通过稀释涂布法获得的 C. 核酸分子杂交的原理是碱基互补配对  D. 从该文库中可筛选到胰高血糖素基因 解析：cDNA 是以 mRNA 为模板，经逆转录酶催化形成的，故 cDNA 文库的构建需要用到逆转录酶， A 正确；由图中菌落分布特点可知，图中的菌落是通过稀释涂布法获得的， B 正确；核酸分子杂交的原理是碱基互补配对， C 正确；胰岛 B 细胞内的胰高血糖素基因不表达，所以从胰岛 B 细胞内提取不到胰高血糖素基因的 mRNA ，无法逆转录形成胰高血糖素基因的 cDNA ，故不能从利用人胰岛 B 细胞构建的 cDNA 文库中筛选到胰高血糖素基因， D 错误。故答案为 D 。 试题中涉及了cDNA文库的构建。 那么，cDNA文库是如何构建的？ 一些学生认为，cDNA文库的构建需要逆转录酶和DNA聚合酶，原因可能是形成DNA双链时需要DNA聚合酶，这种观点是错误的， 因为只需要逆转录酶就可以，主要是因为逆转录酶的功能是多方面的。 1.逆转录酶的发现和意义 1970年美国科学家Howard Temin和David Baltimore分别在动物致癌RNA病毒中发现了逆转录酶，并因此获得了1975年诺贝尔生理学或医学奖。该发现揭示了生物体的遗传信息不仅可以从DNA到DNA（DNA自我复制）、从RNA到RNA（RNA自我复制）、从DNA到RNA（转录），还可以从RNA到DNA(逆转录)，进而补全了中心法则。 逆转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在逆转录酶的作用下，合成出互补的DNA(cDNA)，由此可构建出cDNA文库，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。 2.逆转录酶的酶学特性 逆转录酶是一种RNA依赖的DNA聚合酶，其本质是病毒编码的蛋白质，能够催化以RNA为模板合成互补的DNA。即逆转录酶属于DNA聚合酶的一类，可以聚合dNTP合成cDNA链，这一过程的发生，依赖于逆转录酶的两大活性：DNA聚合酶活性和核糖核酸酶（RNase H）活性。 DNA聚合酶活性：有两种情况，一种是RNA指导的DNA聚合酶活性：以RNA为引物，在引物RNA的3′末端以5′→3′方向合成DNA。值得注意的是该酶不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，会导致DNA出错率比较高。另一种是RNA指导的DNA聚合酶活性：以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。 RNase H活性：DNA链容易与RNA链形成DNA-RNA杂交链，RNase H是一种核糖核酸内切酶，RNase H可以水解杂交链上的RNA。该酶不能消化单链或双链DNA。 3.逆转录过程（cDNA文库构建过程中） 逆转录酶是由不同生化活性的不同结构酶组成。尽管不同生物体来源的逆转录酶功能存在或多或少的差异，包括如DNA依赖性DNA聚合酶活性，但逆转录酶的主要功能仍取决于RNA依赖性DNA聚合酶和RNase H酶活性。逆转录过程通常涉及许多步骤： 在存在退火引物的条件下，逆转录酶结合到RNA模板并引发反应；RNA依赖性DNA聚合酶活性通过掺入dNTPs合成互补DNA链；RNase H活性降解DNA－RNA复合物中的RNA模板；DNA依赖性DNA聚合酶活性识别单链cDNA作为模板，使用RNA片段作为引物，合成第二链cDNA，最终形成双链cDNA。 4.逆转录酶的种类 目前，市面上常用的两种逆转录酶：AMV和M-MLV。它们拥有着不同的特征，如表所示。 虽然野生型M-MLV逆转录酶的热稳定性差，抵抗复杂结构的RNA能力弱，但通过对其进行改造可弥补这些不足。渐渐地，改造后的M-MLV逆转录酶成为了市场的主流产品。 5.cDNA文库构建的主要过程 cDNA文库的构建是一个复杂的过程，主要包括以下步骤： （1）mRNA的提取和纯化。从组织或细胞中提取总RNA，并纯化得到高质量的mRNA； （2）cDNA第一链的合成。使用多聚胸腺嘧啶(dT)作为引物，以mRNA为模板，通过逆转录酶合成cDNA第一链； （3）cDNA第二链的合成。以第一链cDNA为模板，利用DNA聚合酶合成cDNA第二链； （4）双链cDNA的修饰和连接。对双链cDNA进行修饰，加入接头序列，然后与经过内切酶切割的载体连接，形成重组载体； （5）重组载体的转化。将重组载体转化进入受体细胞； （6）文库的鉴定和评价。对构建的cDNA文库进行鉴定和评价，确保其代表性和序列完整性；