3.2.2 DNA片段的扩增及电泳鉴定课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

PCR体外扩增仪 微量移液器 电泳结果图 凝胶电泳仪器 3.2.2 DNA片段的扩增及电泳鉴定 1 学习目标 1.了解PCR和电泳鉴定的基本原理（科学思维）。 2.认识微量移液器，并学会微量移液器的正确操作（科学探究）。 3.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物（科学探究）。 学习重难点 教学重点： DNA片段的扩增及电泳鉴定。 教学难点： 利用PCR扩增目的基因； DNA片段的扩增及电泳鉴定。 探究•实践 利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚和结合； 实验原理： PCR产物一般通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子大小和构象有关； 凝胶中DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下检测出来。 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动； 探究•实践 实验目的： 1. 了解PCR和电泳鉴定的基本原理； 2. 尝试进行PCR的基本操作并电泳鉴定PCR的产物。 材料用具： 1.主要仪器用具 PCR仪 微量移液器 核酸电泳装置 吸液枪头 离心管 探究•实践 材料用具： 2.实验试剂： 4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水；电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。 PCR试剂盒 琼脂糖 电泳缓冲液 电泳指示剂 探究•实践 实验步骤： 1.用微量移液器按照下列配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分； 10倍浓缩的扩增缓冲液 5uL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸等量混合液 1uL 20umol/L的引物I、II 2.5uL H2O 28~33uL 1~5U/uL的TaqDNA聚合酶 1~2U 模板DNA 5~10uL 总体积 50uL DNA模板的量为1pg~1ug，如果模板浓度过高，需要进行稀释处理。 探究•实践 实验步骤： 2. 待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在管的底部。 3. 参照下表中的参数，设置好PCR仪的循环程序，将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃，5min — — 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min 高温变性使双链彻底打开 将没有配对完成的双链继续配对，补链 探究•实践 实验步骤： 4. 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8~1.2%的琼脂糖溶液，在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料； 5. 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 琼脂糖高温熔化才能完全溶解，呈透亮澄清的状态。 加样梳子 凝胶上的加样孔 琼脂糖倒入模具 探究•实践 实验步骤： 6. 待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 7. 将电泳缓冲液加入电泳槽内，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 8. 将扩增的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内，留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。 第一列为标准参照物 加样操作 探究•实践 实验步骤： 9.接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离设定电压，一般是1~5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 10. 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 凝胶样品 凝胶成像系统 探究•实践 1.避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理； 注意事项： 2.实验采购的酶、缓冲液应该进行分装，并在-20℃保存；使用前将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 为什么要进行分装？为何要在冰块上缓慢融化？ 避免多次使用，多次冻融，降低酶的活性；分装可以减少酶和缓冲液交叉污染。冰块上缓慢融化可以减少对酶活性的破坏。 3.在微量离心管中添加各种组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 防止交叉污染 探究•实践 1. 你是否成功扩增出DNA片段？判断依据是什么？ 分析与评价 可以对扩增的产物进行进行电泳，并将凝胶放在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。 2. 你进行电泳鉴定的结果是几条带？如果不止一条带，请分析产生这个结果的可能原因。 如果扩增不成功，可能是：漏加了PCR反应成分，反应成分用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结