2024届高考生物二轮复习热点：基因工程

1 热点一：PCR 技术及其应用 1、PCR 技术与病毒检测——实时荧光定量 PCR(RT－PCR) 新型冠状病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光 PCR 鉴定。先从样本中提取 RNA，RNA 中 可能有新冠病毒的 RNA，同时也存在很多采样患者的组织和存在于采样部位的微生物的 RNA。通 过逆转录酶将样本的 RNA 逆转录为 cDNA，并进行 PCR 扩增，在 PCR 反应体系中，包含一对特异 性引物以及一个探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭 荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若反应体系存在靶序列，PCR 反应时探针与模板结合，DNA 聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基 团分离，发出荧光。每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子产生。荧光定量 PCR 仪能够监测出荧 光到达预先设定阈值的循环数(Ct 值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct 值越小(如图)。 （1）RT(reverse transcription)-PCR 即 反转录聚合酶链反应，是将 RNA 的反转录 和 cDNA 的聚合酶链式扩增 （PCR） 相结 合的技术。 （2）优点：早期诊断、灵敏度和特异性 高，判断是否感染新冠病毒的直接接证据。 2、重叠延伸 PCR 技术 重叠延伸 PCR 技术是一项重要的基因 定点突变技术，其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物 2 和 3，突起处代表 与模板链不能互补的突变位点)，分别进行 PCR，获得有重叠链的两种 DNA 片段，再在随后的扩 增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。 （1）PCR 扩增过程 高温变性：温度超过 90 ℃，双链 DNA 解聚为单链 低温复性：温度下降到 50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合 中温延伸：温度上升到 72 ℃左右，溶液 中的 4 种脱氧核苷酸在耐高温的 DNA 聚合 酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成 新的 DNA 链 3、大引物 PCR 技术 大引物 PCR 需要用到三条引物进行两 轮 PCR，这三条引物分别是突变上游引物、 常规上游引物和常规下游引物。该技术的 流程如图所示。 第一轮 PCR 利用突变上游引物和常规 下游引物进行扩增，得到不完整的含有突 变位点的 DNA 片段； 第二轮 PCR 利用第一轮扩增产物中的 一条 DNA 链作为下游大引物，它与常规上 游引物一起扩增得到完整的含有突变位 点的 DNA 片段。 2 引物设计需要遵循以下原则： 1、引物最好在模板 cDNA 的保守区内设计。 DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。各基因相同的序列就是该基因的保守 区。 2、引物长度一般在 15-30 碱基之间 引物长度（primer length）常用的是 18-27 bp，但不应大于 38，因为过长会导致其延伸温 度大于 74℃，不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应。 3、引物 GC 含量在 40%-60%之间，Tm 值最好接近 72℃。 4、引物 3′端要避开密码子的第 3 位。 如扩增编码区域，引物 3′端不要终止于密码子的第 3 位，因密码子的第 3 位易发生简并， 会影响扩增的特异性与效率。 5、引物 3′端不能选择 A，最好选择 T。 引物 3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为 A 时，即使在错 配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为 T 时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配 的引发效率介于 A、T 之间，所以 3′端最好选择 T。 6、碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高的序列，尤其是 3′端相似性较高的序列，否则容易 导致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布 最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其 3′端不应超过 3 个连续的 G 或 C，因这样 会使引物在 GC 富集序列区错误引发。 7、引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。 这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免 3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer 与 Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续 4 个碱基的互补。 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G 值不要过高（应小于 4.5kcalmol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使 PCR 反应不能正常 进行。（△G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能