备课素材：PCR反应的要素-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

PCR反应的要素 一、PCR反应组分 1.模板DNA： 来源比较广，用于复制的PCR模板可以是任何DNA来源，如基因组DNA（gDNA）、互补DNA（cDNA）和质粒DNA。不过，DNA的组成或复杂度会影响PCR扩增的最佳起始量。例如，在起始量为50 µL 的PCR中，只需0.1–1 ng质粒DNA，而gDNA则需要5–50 ng。最佳模板起始量还取决于所使用的 DNA 聚合酶类型；经过改造 的DNA聚合酶对模板的亲和力更强，灵敏度更高，所需的DNA起始量更少。对DNA起始量的优化很重要，因为起始量过高会增加发生非特异性扩增的风险，而起始量过低会降低得率。 有时候，PCR实验方案会使用拷贝数表示DNA起始量，特别是gDNA。拷贝数的计算取决于分子的数量，即DNA起始摩尔量。用Avogadro常数（L）和摩尔质量计算拷贝数，公式如下： 拷贝数 = L × 摩尔数 = L ×（总质量/摩尔质量） 特定DNA链的摩尔质量取决于其大小或总碱基数（即其长度和单链或双链特性的组合）。 理论上，单拷贝DNA或单个细胞在理想条件下足够用于PCR扩增。但在实际情况中，特定模板量的扩增效率很大程度上取决于反应组分和反应参数，以及DNA聚合酶的灵敏度。  除了gDNA、cDNA和质粒DNA，可通过再次扩增PCR产物，得到更高的目标DNA得率。尽管未纯化的PCR产物可以直接再次用作模板，但是引物、dNTP、盐和副产物等遗留反应成分会对扩增造成不利影响。为了避免这种抑制作用，通常建议在下一轮PCR前用水稀释反应。如需获取最佳结果，应在再次扩增前将PCR扩增子进行纯化。  模板DNA的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组分，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。   2.脱氧核苷三磷酸（dNTP）： 四种dNTP（dATP、dCTP、dGTP和dTTP）是PCR原料，其比例和浓度与PCR密切相关。dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应用1M NaOH或1M Tris配成高浓度后，HCI的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200 μmol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。但是，在某些情况下，如通过PCR方法进行随机突变，偶尔也会使用浓度不等的dNTP，以促进非校正DNA聚合酶产生更多的错误碱基插入。 dNTP储存液：dNTP溶于pH为7.0的NaOH贮存液中，最初的贮存液可稀释到10 mol/L，分装后存放在-20℃冰箱中。dNTP使用浓度在20～200 μmol/L之间。4种dNTP必须等浓度配合以减少错配误差。 dNTP使用浓度：在PCR反应中，使用低dNTP浓度，可减少非靶位置启动和延伸时的核苷酸错误掺入。在常见的PCR应用中，各种dNTP的常用终浓度通常为0.2 mM。一般可根据靶序列的长度和组成来决定最低dNTP浓度。例如在100 μl的反应体系中，4种dNTP的浓度为20 μmol/L，可基本满足合成2.6 μg DNA或10 pmol/L的400bp序列。使用低dNTP浓度(每种dNTP浓度为2 μmol/L)，能够高度灵敏地(1/107)扩增ras基因点突变的等位基因。 有时，使用高浓度dNTP也可能也是有益的，特别是在存在高浓度 Mg2+的情况下，因为Mg2+可与dNTP结合，减少可被引入的dNTP量。但同时，当dNTP超过最佳浓度时，会抑制PCR反应。为使DNA聚合酶完成有效扩增，反应中的游离dNTP浓度不得超过 0.010–0.015 mM（其估计 Km值）。当使用非校正DNA聚合酶时，可通过降低dNTP浓度（0.01–0.05 mM）和成比例减少 Mg2+来提高保真度。  3.Taq DNA聚合酶： DNA聚合酶是PCR的重要组成部分，它们能够从单链DNA模板合成新的互补链。所有DNA聚合酶都具有 5′→ 3′ 聚合酶活性，即掺入核苷酸并使引物从按5'至3’方向延伸。 图1：DN