第3章 基因工程（知识清单）-2023-2024学年高二生物下学期期中考点大串讲（人教版2019选择性必修3）

第三章 基因工程 第一节 重组DNA技术的基本工具 一、DNA基因工程的基本工具 DNA基因工程至少需要三种工具：“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）；“分子缝合针”——DNA连接酶；“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体。 （1）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） ①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 ②功能：能识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 ③结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：粘性末端和平末端。 （2）“分子缝合针”——DNA连接酶 ①两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较： a.相同点：都缝合磷酸二酯键。 b.区别：E·coli DNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的粘性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 ②与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 （3）DNA连接酶——“分子缝合针” ①作用:将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 ② 种类: 种类 来源 特点 E.coliDNA连接酶 大肠杆菌 只能“缝合”具有互补粘性末端的双链DNA片段 T4DNA连接酶 T4噬菌体 既可以“缝合”双链DNA片段互补粘性末端，又可“缝合”双链DNA片段的平末端。 （4）“分子运输车”——载体 ①载体具备的条件： a.能在受体细胞中复制并稳定保存。 b.具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 c.具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 ②最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 ③其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒 二、DNA的粗提取与鉴定 1. 实验原理: (1) DNA、 RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面有差异, 选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。 ①DNA 不溶于酒精, 某些蛋白质溶于酒精, 分离 DNA 和蛋白质。 ②DNA 能溶于 2mol/L 的 NaCl 溶液。 (2) DNA 遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 2. 方法步骤: (1) 研磨:取 30g 洋葱切碎, 倒入 10 mL 研磨液研磨。 (2) 除杂: 漏斗中垫上纱布过滤后, 在 4 ℃冰箱静置后取上清液, 1 500 r/min 的转速下离心后取上清液。 (3) 提取: 加入体积相等、 体积分数 95%酒精, 溶液出现白色的丝状物是 DNA。 方法一: 用玻璃杯按一个(填“一个” 或“两个” ) 方向搅拌，卷起丝状物，用滤纸吸去上面的水分。 方法二: 10 000 r/min 的转速下离心 5 min, 取沉淀物晾干。 （4）鉴定: 项目 A B 2mol/L的Nacl溶液5mL 丝状物或沉淀物 不加 加入 二苯胺试剂4mL 沸水中加热5分钟 现象 无色 蓝色 DNA 的鉴定和还原糖的鉴定都需要加热, 它们有什么不同? 提示:还原糖加斐林试剂后, 置于 55～65 ℃热水中加热; 而 DNA 加二苯胺试剂后, 置于沸水中加热。 第二节 基因工程的基本操作程序 基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 1.第一步：目的基因的获取 （1）目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因 。 （2）原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因常用方法有反转录法和化学合成法 （3）PCR技术扩增目的基因 ①原理：DNA双链复制 ②过程： a：加热至90-95℃DNA解链； b：冷却到55-60℃，引物结合到互补DNA链； c：加热至70-75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。 2.第二步：基因表达载体的构建 （1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 （2）组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因 ①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 ②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端。 ③标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。 3.第三步：将目的基因导入受体细胞 （1）转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，