备课素材：动物细胞工程问题释疑-2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3

动物细胞工程问题释疑 1.贴壁生长出现接触性抑制的原因是什么? 貼壁生长:是指细胞贴附在一定的固相表面进行的生长。并不是所有的细胞是贴壁生长的,贴壁生长是某些细胞的一种特性,贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养(瓶)器皿壁上,细胞一经贴壁就迅速铺展,然后开始有丝分裂,并很快进入对数生长期。一般数天后就铺满培养表面,并形成致密的细胞单层。贴壁生长的细胞要经过游离期、吸附期、繁殖期和退化期。贴壁生长的细胞可以用蛋白醇等洗脱下来。与贴壁生长相对的是悬浮培养。 原因:细胞分泌细胞外基质,这种细胞外基质黏附在支持物瓶壁上,然后细胞通过表面表达的黏附因子,与这些细胞外基质结合,所以细胞贴壁生长和这些物质有关,不能产生这些物质的细胞就不能贴壁生长,当然和瓶的表面结构也有关。 接触抑制:是指细胞在培养瓶中贴壁生长,长到相互接触时停止繁殖的现象。 原因:细胞增殖到一定程度,也就是互相挨在一起的时候,糖蛋白识别了这种信息,就会使细胞停止继续繁殖。所以瓶壁上生长的细胞是单层的。如果没有了接触抑制的特性,也就会成为肿瘤细胞了。 2.灭活的病毒、聚乙二醇、电激促进细胞融合的原理各是什么? (1)灭活的病毒:主要靠病毒表面含有神经氨酸酶的一些突起(sp-kies)的作用,当病毒位于两个细胞之间,病毒突起上的神经氨酸酶即可降解细胞膜上的糖蛋白,使细胞膜局部凝聚在病毒颗粒的周围,在高pH、钙离子条件下局部细胞质膜即可发生融合 (2)聚乙二醇(PEG):Blow等人证明当聚乙二醇(PEG)浓度增加到50%时,聚乙二醇(PEG)可能与邻近膜的水分子相结合,使细胞之间只有几个埃的水分子被取代,由此降低了细胞表面的极性,导致磷脂双分子层不稳定,引起细胞的融合。 (3)电激:当细胞位于电融合室电介质溶液中,并对融合室施加正弦交变电场,由于在融合室电极之间形成一种均匀的电场,使电介质溶液中的细胞在电场中沿电力线成串排成珠串或排列现象。紧密排列成串的细胞如果进一步在高幅脉冲电场的瞬时作用下,细胞膜局部结构的紊乱,出现许多穿孔,细胞膜的通透性增加,而邻近细胞的紧密接触部位的微孔就有了物质交流,形成膜桥和质桥继而发生细胞融合,当外加电场撤掉后,细胞膜恢复正常的通透性和功能。 3.单克隆抗体制备过程中两次筛选的过程是什么? 经过多次、同种抗原刺激之后,小鼠脾脏中会有很多浆细胞,通过无菌操作的方法获得小鼠脾脏,脾细胞与骨髓瘤细胞融合便形成杂交瘤细胞。在形成的二倍体或者多倍体细胞中,不仅有骨髓瘤细胞与目的效应B细胞之间的融合,也有小鼠骨髓瘤细胞之间的融合及小鼠骨髓瘤细胞和非目的细胞之间的融合,因而就需要用HAT培养基进行选择性初筛。DNA作为具有膜结构的生物体的遗传物质,其合成途径有两种,即主路途径和旁路途径。在主路合成途径中,TK胸苷激酶和HGPRT是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶,两者是此途径不可或缺的酶类,而小鼠骨髓瘤细胞缺乏TK或者HGPRT这两种酶。只有小鼠骨髓瘤与B效应细胞发生融合之后,融合的杂交瘤中有TK或者HGPRT,这时杂交瘤细胞才能正常生长。杂交瘤在HAT培养基中生长7d后再次更换HAT培养基,自此后更换的培养基均为HT培养基,目的是为了去除氨甲喋呤的作用以促进杂交瘤的生长。通过HAT的作用、后期HT培养基的培养和细胞的亚克隆化,能够获得很多的目的杂交瘤细胞株。通常采用有限稀释克隆细胞的方法,将杂交瘤细胞多倍稀释,接种在多孔的细胞培养板上,使每孔细胞不超过1个,通过培养让其增殖,然后检测各孔上清液中的细胞分泌的抗体,上清液可与特定性抗原结合的培养孔为阳性孔。将阳性杂交瘤细胞株腹腔注射到小鼠体内,也可以体外培养杂交瘤株,随后采集腹水或者取细胞培养液后经过纯化,便可以获得针对目的蛋白的单克隆抗体。 4.杂交瘤细胞在小鼠体内培养后, 单克隆抗体如何从腹水中分离纯化出抗体? 有很多方法可利用杂交瘤细胞生产特异性强、灵敏度高的单克隆抗体。目前最常用的方法是向小鼠体内注射杂交瘤细胞,制备腹水。先向小鼠腹腔注射0.5mL液体石蜡,1~2周后向腹腔注射1 106个杂交瘤细胞,接种7~10d后,腹腔渗透压升高致使体液渗入腹腔形成腹水,采集腹水,其单克隆抗体的浓度可达5-20mg/mL[1]。 在单抗纯化之前,一般均需对腹水进行预处理,目的是为了进一步除去细胞及其残渣、小颗粒物质、以及脂肪滴等。常用的方法有二氧化硅吸附法和过滤离心法,以前者处理效果为佳,而且操作简便。 A.二氧化硅吸附法:新鲜采集的腹水(或冻存的腹水),2000r/min 15 分钟,除去细胞成分(或冻存过程中形成的固体物质)等;取上层清亮的腹水,等量加入pH7.2巴比妥缓冲盐水(VBS;0.004mol/L巴比妥,0.15mol/L NaCl,0.8mmol/L Mg2+,0.3mmol/L Ca2+)稀释;然后