备课素材：PCR过程及假阳性-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

PCR过程及假阳性 先看一道试题： PCR反应最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。防止污染的办法不包括（　　） A．将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行 B．吸样枪吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，枪头小套、小离心管应一次性使用，以免交叉污染 C．所有的PCR试剂都应放置于大瓶分装，以减少重复加样次数，避免污染机会 D．PCR试剂、PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱 解析：将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，这样可以防止污染，A正确；吸样枪吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，枪头小套、小离心管应一次性使用，以免交叉污染，B正确；PCR缓冲液和酶应分装成小份，C错误；PCR试剂、PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱，这样可以防止污染，D正确。故答案为C。 这道试题涉及到PCR技术应用中假阳性问题，教材中没有详细介绍。 那么，PCR技术应用中假阳出现的原因是什么？ 聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。 1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。到如今2013年，PCR已发展到第三代技术。1976年，中国科学家钱嘉韵，发现了稳定的Taq DNA聚合酶，为PCR技术发展也做出了基础性贡献。 PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 PCR反应需要3次循环才能得到目的基因 利用PCR技术扩增目的基因的过程如下： PCR扩增的能力是惊人的，经过30次循环就可以得到用于分子生物学研究的量。PCR反应需要经过重复循环变性－退火－延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 由于PCR 的敏感性和效率特别高，所以少量的扩增产物污染标本或反应管即可出现假阳性。尤其是PCR扩增产物和质粒分子很容易造成实验室的污染，导致假阳性现象发生。 假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。 实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。 造成假阳性的原因 1. 样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染； 样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染； 2. PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。 3. PCR扩增产物污染：这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。 4. 气溶胶污染：在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。 据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。 5. 实验室中克隆质粒的污染：由于克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。 在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题比较常见。 假阳性问题的试验控制 在每次PCR检测时，一定设立阴性对照样品和阳性对照样品。阴性对照样品检测为阴性时，表明试验全部过程的试剂没有受到污染； 阳性对照样品检测为阳性时，表明DNA提取（RNA提取、RNA反转录）、DNA扩增和电泳鉴定工作体系正常。在阴性对照样品和阳性对照样品检测结果成立的前提下，才能对检测样品进行判定。 只有设立试验全程的对照，才能证明试验结果成立。 假阳性解决途径 由于PCR 的敏感性和效率特别高，所以少量的扩增产物污染标本或反应管即可出现假阳性。尤其是PCR扩增产物和质粒分子很容易造成实验室的污染，导致假阳性现象发生。 1、