2024届高三生物二轮复习微专题讲义17：PCR的原理和应用

微专题17 PCR的原理和应用 考点1　PCR的原理和操作 【典例剖析】 1.(2023·厦门高三期末)人血清白蛋白(HSA)是血浆蛋白的主要成分，具有维持血浆渗透压和进行物质运输的功能。科学家利用转基因技术获得转HSA基因的大肠杆菌，通过发酵工程，实现HSA的大量生产，图1表示HSA基因，图2表示所用质粒的结构，回答下列问题： (1)PCR过程每次循环分为 3 步，其中温度最低的一步是________。在循环前常要进行一次94 ℃、5 min预变性，其目的是___________________________________________________ ______________________________________________________________________________。 (2)在PCR反应体系中，加入dNTP(dCTP、dATP、dGTP和dTTP)的作用是_________________；在PCR反应缓冲液中还要加入Mg2＋，其作用是______________。目前在PCR反应中使用Taq DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶，主要原因是____________________________ ______________________________________________________________________________。 (3)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增HSA基因。用于扩增HSA基因的引物需满足的条件是___________________________________________________________ _____________________________________________________________________________。 已知DNA复制时，子链延伸的方向是从5′→3′。若要扩增出HSA基因并用于表达载体的构建，应选择的引物是__________________，其作用是_____________________________。 (4)由图2可知，在构建基因表达载体时，最好选用的限制酶是________________。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。至少复制______次即可得到含所需酶切位点的HSA基因。目的基因只有正确插入质粒的__________________之间才能正确表达。 图2中氨苄青霉素抗性基因的作用是____________________________________________________。 (5)将构建的重组质粒导入大肠杆菌，需要用钙离子处理，使大肠杆菌处于______________。 【关键点拨】 1．PCR技术原理与条件 2．PCR技术的过程 变性：加热超过90 ℃，DNA解链 　　　　↓ 复性：冷却至50 ℃左右，引物与互补DNA链结合 　　　　↓ 延伸：加热到72 ℃左右，在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成子链 3．相关数据 项目 n轮循环 DNA分子数 2n 含引物A(或B)的DNA分子数 2n－1 同时含引物A、B的DNA分子数 2n－2 共消耗的引物数量 2n＋1－2 两端等长的DNA分子数 2n－2n 特别提醒　第3次循环后，才会出现两端等长的目的基因片段。 4．PCR技术中“引物”归类分析 (1)引物的作用：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链。不同引物可结合不同的目的基因并进行扩增。 (2)引物的处理 由于引物延伸从3′端开始，3′端不能进行任何修饰，引物5′端对扩增特异性影响不大，因此给予修饰不影响扩增特异性。引物5′端修饰包括加酶切位点、标记生物素、荧光等。为了使经PCR扩增的目的基因能与载体正常结合，需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列。其目的是保证目的基因定向插入载体并避免目的基因自身环化。 【巩固练习】 1．(2021·江苏，23)某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题： (1)目的基因的扩增 ①提取真菌细胞__________，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。 ②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致________________________________________________________