第1节 第2课时 获取目的基因和构建重组DNA分子（Word教参）-【优化指导】2023-2024学年新教材高中生物选择性必修3 生物技术与工程（浙科版2019）

第二课时　获取目的基因和构建重组DNA分子 [对应学生用书P73] 一、基因工程的一系列操作可使生物获得新的遗传特性 1．基因工程的基本操作步骤 2．原核细胞、真核细胞基因结构的差别 　原核细胞 真核细胞 基因的上游有启动子，下游有终止子 基因的上游有启动子，下游有终止子 基因中编码蛋白质的核苷酸序列是连续的 但是编码蛋白质的核苷酸序列是不连续的。编码蛋白质的序列称为外显子，外显子之间不能编码蛋白质的序列称为内含子。 3．获取目的基因的方法 (1)化学合成法： 需要已知目的基因的全部序列，成本较高，适于合成序列较短的基因 (2)借助载体建立基因文库 ①通过构建基因组文库获得目的基因 ②通过构建cDNA文库获得目的基因 4．PCR技术 (1)原理：DNA半保留复制 (2)基本条件：①待扩增的DNA分子是模板；②原料是4种脱氧核苷酸；③酶是耐高温的TaqDNA聚合酶；④引物是根据目的基因的核苷酸序列人工合成两段短的单链DNA 5．PCR每个循环分为3个步骤 6．电泳：该技术是分离、鉴定、纯化核酸和蛋白质的常用方法。 1．PCR扩增 2．琼脂糖凝胶电泳 (1)制备琼脂糖凝胶 (2)加样 用微量移液器向500 uLPCR产物中加入10 uL6×上样缓冲液并反复吹吸混合均匀→将20 uL样品混合液缓慢加到加样孔内。将20 uL DNA Marker与4 uL6×上样缓冲液混合均匀，全部加到加样孔内；若市售DNA Marker已含有上样缓冲液则无需混合，直接加样25 uL。第加样一次需换一次枪头 (3)电泳 盖上电泳槽盖，连接好电极插头后再接通电源。将直流电泳仪的电压设置成80 V，开始电泳。25 min后关闭电源，停止电泳。注意观察溴酚蓝不要移出凝胶。 3．染色 将凝胶放入培养皿，倒入0.1%亚甲基蓝溶液，没过凝胶5 cm→染色8 min轻轻晃动培养皿，让染液进入凝胶下表面与培养皿之间，不要留气泡。染液使用后可回收利用→倒入75%酒精没过凝胶约5 mm，不断晃动培养皿1～1.5 min。再倒去酒精→加入冷的蒸馏水进行脱色。当出现清晰的蓝色区带时，倒去蒸馏水终止脱色。如果凝胶在蒸馏水中浸泡过条带颜色会变淡直至无色。 4．观察 在桌上铺一张白纸，在光下手持盛有凝胶培养皿距白纸5 cm以上，找到较为清晰的条带。蓝色条带即为DNA所在位置。注意观察条带的数目和位置。再将凝胶置于平的透明玻璃板上，放在三脚架上面进行观察并拍照，用直尺紧贴凝胶表面测量DNA条带迁移距离。根据已知 Marker每个条带的位置和相应DNA片段长度，推测PCR产物长度。 三、利用表达载体构建重组DNA分子 1．构建目的：使目的基因既能扩增又能表达出相应蛋白质的载体。 2．组成：复制起点、标记基因、多个限制酶的识别序列、启动子、终止子等。 3．构建过程：用同种限制性内切核酸酶剪切含有目的基因的DNA片段以及表达载体，然后用DNA连接酶将它们连接起来，如图。 . 1．判正误 (1)核酸分子是带有负电的生物大分子，在电场作用下，可向正极方向迁移，其迁移速率主要受核酸片段长度影响。(√) (2)DNA本身是无色的，一般使用荧光或放射性染料对DNA进行标记，或使用甲基绿染液将DNA染成绿色。(×) (3)电泳时常用凝胶作为介质，凝胶的孔隙可起到分子筛的作用；电泳缓冲液的主要作用是在电泳过程中维持合适的pH，并使溶液具有一定的导电性。(√) (2)构建重组DNA分子时，必须使用同一种限制酶分别切割表达载体和含有目的基因的DNA片段。(×) (5)重组DNA分子的复制和目的基因的表达均启动于复制起点。(×) (6)目的基因必须位于重组质粒的启动子的“上游”或终止子的“下游”才能进行表达。(×) 2．微思考 (1)PCR过程中需要解旋酶吗？所需要的DNA聚合酶应具有什么特点？ 提示　PCR过程中，DNA双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶；由于PCR过程温度较高，所以需要能耐高温的TaqDNA聚合酶。 (2)克隆载体上是否一定有转录和翻译信号？表达载体上是否具有复制信号？ 提示　克隆载体用于扩增外源DNA，含有复制起点，可以不含有转录和翻译信号。表达载体既能扩增目的基因，又能表达出相应的蛋白质，因此既含有复制起点，又含有转录和翻译信号。 [对应学生用书P76] 任务驱动一　PCR技术 聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，下图为PCR扩增中第一轮的变化，结合所学回答下列问题： (1)PCR的原理是什么？ 提示　DNA半保留复制原理。 (2)PCR过程中设计引物时引物碱基间能否互补？ 提示　引物需要分别与模板DNA分子的每一条单链互补，引物间不能互补配对。 (3)PCR过程中若模板DNA分子中G、C碱基对含量较多，则变性时间会怎样？ 提示　若