3.2基因工程的基本操作程序讲义-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

基因工程的基本操作程序 1．目的基因的筛选与获取 目的基因：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 种类：主要是编码蛋白质的基因，也有调控作用的因子。 筛选：1）从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选，比如Bt基因 Bt基因：来自苏云金杆菌，表达出Bt抗虫蛋白（苏云金杆菌伴孢晶体蛋白）：害虫食用后，在害虫肠道内分解成多肽，多肽与肠上皮特异性受体结合，造成肠道穿孔，导致害虫死亡，不会对人畜危害。 种植抗虫棉的地方都会留一部分区域种非转基因棉花：为少部分害虫提供一个正常的取食环境，始终保持一定的敏感目标害虫种群，这样即使害虫对转基因抗虫棉产生了抗性，但与其敏感目标交配，后代抗性基因会发生分离，害虫的种群不至于增加。 2） 序列数据库，序列比对工具。 序列数据库是分子生物信息数据库中最基本的数据库，包括核酸和蛋白质两类，以核苷酸碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容，并附有注释信息。 获取： 1）利用PCR获取和扩增目的基因 2）人工合成：反转录法：用于相对分子量较大而又不知道其核苷酸序列的基因。 化学合成法：已知目的基因核苷酸序列，且基因比较小，可以通过DNA合成仪合成。 3） 构建基因文库：不知道目的基因的核苷酸序列，构建基因文库：基因文库包括基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库）。将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。如果这个文库包含了某种生物的所有基因，那么，这种基因文库叫做基因组文库。如果这个文库只包含了某种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库，例如cDNA文库，首先得到mRNA，再反转录得cDNA，形成文库。cDNA文库与基因组文库的区别在于cDNA文库在mRNA拼接过程中已经除去了内含子等成分，便于DNA重组时直接使用。 拓展：1、核酸杂交法核酸杂交法是从基因文库中获取目的基因比较有效而快速的一种方法。用带放射性标记的特异DNA作为探针，通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩瀚的基因组中把目的基因显示出来。 显然，筛选的关键是获得特异性探针。如果目的基因的序列是已知的或部分序列已知，那么获取探针就很容易，但大部分情况下，目的基因的序列是未知的，这时探针的来源有：①以某种生物实验体系中已分离到的基因序列，作为从与之有亲缘关系的生物中分离相关基因的核酸探针，因为亲缘关系相近的生物之间，基因编码序列的同源性高于非编码区的序列。 ②由于蛋白质家族的保守性，功能相同或相近的蛋白质具有共同氨基酸序列的区段。因此，可根据蛋白质序列来合成基因探针。但由于密码子具有简并性，通过蛋白质氨基酸序列合成的寡核苷酸探针，通常是混合物的形式，在这种探针库中，只有一种是与目的基因完全互补的。2 PCR筛选法 PCR技术除了可以扩增目的基因外，还可以分离目的基因。PCR筛选法操作简单，但前提是要知道目的基因的一段序列，并获得基因特异性引物。要从一个基因组文库中获取目的基因，可先将整个基因文库（以受体菌形式）保存在多孔培养板上，用设计好的目的基因引物进行PCR筛选，鉴定出阳性孔。 3 根据表达产物筛选目的基因基因文库是用基因表达载体构建的，每个克隆都可以在受体菌中表达，产生一段多肽。如果目的基因序列完全未知，但对该基因表达产物有一定的了解，那么可以用以下几种方式筛选出目的基因： ①免疫筛选法。用特异性抗体可以十分灵敏地检测到目的基因的表达产物。 ②检测表达产物功能活性。例如，若产物是酶，可通过酶促反应来检测。 ③检测产物蛋白质的结构和性质。如产物的相对分子质量、肽谱等。 PCR：聚合酶链式反应 定义：在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 原理：DNA半保留复制 人物：穆利斯等人 组分：模板→DNA（目的基因） 原料：4种脱氧核苷酸 酶：耐高温的DNA聚合酶：催化合成DNA子链 两种引物：使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。 缓冲液：提供合适的酸碱度与某些离子，如镁离子，真核细胞和细菌的DNA聚合酶需要镁离子激活。 仪器：PCR扩增仪 过程：变性、复性、延伸 方式：指数形式扩增(约为2n，n为扩增循环的次数) 方向：5’→3’ 产物检测：琼脂糖凝胶电泳 引物：一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸（可以是DNA也可以是RNA）（所以需要已知的一段目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物，） 长度：通常20-30个核苷酸 拓展： 引物设计必须遵循三条最基本的准则： ①引物与模板的序列要紧密互补； ②引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构； ③引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。 具体实现这三条最基本准则需要考虑到诸多因素，如引