3.2.1 基因工程的基本操作程序课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

3.2 基因工程的基本操作程序 从社会中来 我国自上世纪80年代起就使用菊酯类农药杀灭棉铃虫。但到了1992年，棉铃虫产生了极强的耐药性，可以在农药中游泳，鸡吃虫却被毒死，从过量撒药到人工捉虫，传统手段已经对棉铃虫束手无策，不仅农民收成全无，还产生了大量农药中毒的例子，这时候我们把目光转向了新型的生物技术--转基因抗虫棉。 1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。 思考： 1.转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗? 2.培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤? 通过实验将细菌的“杀虫基因”转到棉花里，产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白(Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。 P77 ①目的基因的筛选与获取 ②基因表达载体的构建 ③将目的基因导入受体细胞 ④目的基因的检测与鉴定 一、目的基因的筛选与获取 用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。 1.目的基因 2.目的基因的筛选方法 （1）从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。（较为有效的方法） 如科学家知道苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关并掌握了Bt基因的序列信息；Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才表现出毒性，对人和牲畜无影响。 （2）利用测序技术、序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因。 一、目的基因的筛选与获取 3.目的基因的获取 （1）从基因文库中获取 概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。 分类：①基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。 ②cDNA文库：含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。 cDNA：先由mRNA在逆转录酶作用下获得单链DNA，再利用DNA聚合酶，将单链DNA复制，产生双链DNA，即为cDNA。 （2）人工合成法 在已知目的基因核苷酸序列且基因较小的情况下，利用DNA合成仪自动合成。 （3）利用PCR(特异性)扩增目的基因（常用） 阅读P77，获取PCR的定义、条件、大致过程。 提取某种生物的全部DNA 多个一定大小的DNA片段 将DNA片段与载体连接，导入受体菌中储存 用适当的限制酶切割 基因组文库 构建 基因组文库的构建 某种生物的单链mRNA 单链互补DNA 双链cDNA片段 导入受体菌中储存 与载体连接 cDNA文库 逆转录酶催化 DNA聚合酶催化 部分基因文库（如cDNA文库）构建 构建 PCR（聚合酶链式反应） 1.原理： DNA半保留复制 2.条件： 模板（目的基因）、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、缓冲溶液（含Mg2+ ) 3.过程： 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 4种脱氧核苷酸（dNTP） 引物 待扩增的DNA片段（模板） 5’ 5’ 变性 复性 延伸 温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。 PCR（聚合酶链式反应） PCR（聚合酶链式反应） 4.优点： 可以在短时间内大量扩增目的基因 PCR技术与DNA复制过程比较 PCR技术 DNA复制 相同点 原则 原料 条件 不同点 解旋方式 场所 酶 结果 碱基互补配对 四种脱氧核苷酸 模板、能量、酶 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化 体外复制 细胞内（主要在细胞核内） 耐高温的DNA聚合酶 解旋酶、DNA聚合酶 大量的DNA片段 形成整个DNA分子 思考·讨论 (1)PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？ 不是，PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。 (2)经过第几轮扩增后，循环产物中出现位于两种引物之间的DNA片段？ 比例是多少？ 3 1/4 (3)如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？ 以指数方式扩增，即2n（n为扩增循环的次数） 根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。 补充——引物设计原则P77： 1.长度适当（20-30bp）； 2.引物内部不发生碱基互补配对； 3.引物之间不发生碱基互补配对； 4.GC含量适宜。 知识回顾 （1）PCR的概念: PCR是__________________的缩写，是一项根据__________________的原理，在______提供参与DNA复制的__________与______