3.2.2 基因表达载体的构建-2023-2024学年高二生物同步优选备课一点通（人教版2019选择性必修3）

基因工程的基本操作流程 目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 第一步 第二步 1 ⑴让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代。⑵使目的基因能够表达和发挥作用。 第二步：基因表达载体的构建（核心） 1.构建目的： 2.载体组成： 目的基因 基因表达载体 启动子 限制酶切割位点 终止子 标记基因 复制原点 限制酶切割位点 ⑴启动子： 一段有特殊序列结构的DNA片段 ①本质： ②位置： 位于基因的上游，紧挨转录的起始位点 ③功能： 是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA ④特殊类型： 诱导型启动子（诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达）。 构建基因表达载体常用的启动子一般可以分为组成型启动子和诱导型启动子。 组成型启动子：在生物体的所有组织中都有活性的启动子。 诱导型启动子：能被诱导表达的启动子。 2 ⑵终止子： ①本质： 一段有特殊序列结构的DNA片段 ②位置： 位于基因的下游 ③功能： 使转录在所需要的地方停下来 ⑶标记基因： ①作用： 便于重组DNA分子的筛选 ⑷目的基因： ②常见类型： 抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。 如Bt基因。 ⑸复制原点： 使质粒完成自主复制 第二步：基因表达载体的构建（核心） 目的基因 基因表达载体 启动子 限制酶切割位点 终止子 标记基因 复制原点 限制酶切割位点 目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子和终止子之间的部位，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 位置 功能 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 DNA片段 DNA片段 mRNA上三个相邻的碱基 mRNA上三个相邻的碱基 基因的上游 基因的下游 mRNA首端 mRNA尾端 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号（编码氨基酸） 翻译的结束信号（不编码氨基酸） 重组DNA分子 限制酶 3.基因表达载体的构建过程 目的基因 限制酶切割位点 获取目的基因 连接酶 限制酶 启动子 限制酶切割位点 终止子 标记基因 复制原点 质粒 同种限制酶或能产生相同末端的限制酶 ？ 第二步：基因表达载体的构建（核心） 载体(质粒） 含有目的基因的DNA片段 同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割 DNA连接酶 带有黏性末端（或平末端）的切口 带有相同黏性末端（或平末端）的目的基因片段 重组DNA分子（重组质粒） 第二步：基因表达载体的构建（核心） 基因表达载体≠载体：基因表达载体与载体相比增加了目的基因。 1.切割载体和切割含有目的基因的DNA片段的限制酶应符合什么条件？为什么？ 应为同种限制酶或能产生相同末端的限制酶。 产生相同的黏性末端或平末端，以便通过DNA连接酶连接。 不一定，载体和目的基因都可能出现自身环化或自身连接。 三种：载体-载体、目的基因-目的基因、载体-目的基因 3.用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA，再用DNA连接酶处理后，一定会形成重组DNA分子吗？ 2.用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA，再用DNA连接酶处理后，可能有几种产物（只考虑两两连接）？ 第二步：基因表达载体的构建（核心） 5.如何避免上述问题？ 不一定，目的基因可能反向连接到质粒上。 同时用两种限制酶切割含目的基因的DNA片段和载体（使得目的基因的一端与载体一端的黏性末端相同，而目的基因的另一端与载体另一端的黏性末端相同）。 这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体细胞。 6.将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样？ 4.用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA，再用DNA连接酶处理后，形成的“载体-目的基因”产物一定符合要求吗？ 第二步：基因表达载体的构建（核心） 实际应用中往往选择两种不同的限制酶对目的基因和载体分别切割（防止自身环化和反向连接），用标记基因对重组DNA进行筛选。 4.基因表达载体构建时有关限制酶的选择 选择限制酶时要考虑目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。 第二步：基因表达载体的构建（核心） 思考：构建下图所示基因表达载体时限制酶如何选择？ 4.基因表达载体构建时有关限制酶的选择 (1)根据目的基因两端的限制酶切位点确定限制酶的种类 ①应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst Ⅰ。 ②不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sma Ⅰ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环