3.2 基因工程的基本操作程序（第三课时）（精美课件）- 2023-2024学年高二生物同步精品课堂（人教版2019选择性必修3）

第3章 基因工程工程 第2节 基因工程的基本操作程序 第三课时 DNA片段的扩增及电泳鉴定 目标 01 02 03 针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。 （科学探究） 结合实例，采用文字和图示方式说明基因工程的基本操作程序。（科学思维） 运用结构与功能观等观念理解PCR技术的过程、原理、条件等（生命观念） 学习目标 2 基因工程的基本操作程序 目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 第一步 第二步 第三步 第四步 目的基因的检测与鉴定 前提 核心 关键 保证 利用PCR获取和扩增 目的基因、启动子、终止子、标记基因 农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、 感受态细胞转化法(微生物); 分子检测：是否插入、转录、翻译 个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。 温故知新：基因工程的基本程序 3 实验原理 材料用具 实验步骤 DNA体外扩增的原理 DNA片段电泳鉴定原理 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实验 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实验 一、实验原理 （一）DNA体外扩增的原理： ①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。 ②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理； PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 变性 90˚C 延伸 72˚C 退火 50˚C DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实验 一、实验原理 电泳鉴定原理 DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。 （一）DNA体外扩增的原理： DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实验 一、实验原理 （二）DNA片段电泳鉴定原理： DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实验 二、材料用具 （一）仪器： PCR仪 微量离心管 电泳装置 微量移液器 自动控温，实现DNA的扩增 实际上是进行PCR反应的场所 用于向微量离心管转移PCR配方中的液体 包括电泳仪、电泳槽等 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实验 二、材料用具 （二）材料： ①4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。 ③PCR反应体系的配方(见教材) ②电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实验 二、材料用具 三点提醒 在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段；PCR引物一般为DNA片段。 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。 1 2 3 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实验 三、实验步骤 （一）DNA片段扩增的具体过程： 1 2 3 移液：用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。 离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）。 扩增：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实验 三、实验步骤 （二）PCR扩增产物电泳鉴定的具体过程： 制备凝胶 电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 进行电泳 将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 观察鉴定 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 ①融化： ②倒模: ③凝固: ①加液： ②加样： ③电泳： DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实验 三、实验步骤