3.2.2DNA片段的扩增及电泳鉴定课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3

DNA片段的扩增及电泳鉴定 DNA片段的扩增 一、PCR扩增原理 1.PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合； PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环； 2.PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL 总体积 50μL PCR反应体系的配方 DNA片段的扩增 推动杆 调节旋钮 卸枪头按钮 体积刻度 吸液杆 枪头 （注意：加不同样品时，需要更换枪头） 二、材料用具 ①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增） ②微量离心管（进行PCR反应的场所） ③微量移液器 （用于向微量离心管转移PCR配方中的液体） ④一次性吸液枪头（微量移液器吸取 一种试剂更换一次枪头） DNA片段的扩增 三、方法步骤 DNA片段的扩增 1．移液 2．离心 3．反应 用微量移液器按照配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。 三、方法步骤 DNA片段的扩增 1．移液 2．离心 3．反应 待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。 将微量离心管放在离心机上，离心约10 s，使反应液集中在管的底部。（提高反应速率）离心的目的 注：离心管的盖子一定要盖严，防止实验中盖子脱落或液体外溢 三、方法步骤 DNA片段的扩增 1．移液 3．离心 4．反应 将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min / / 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min 预变性使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合 三、方法步骤 DNA片段的扩增 扩增1000bp片段一般设定延伸时间设定为1min，故可根据目的基因片段长度适当调整延伸的时间 DNA片段的扩增及电泳鉴定 1．琼脂糖凝胶电泳原理 ①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。 ②迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 一般DNA分子在一定pH的缓冲液中可以带负电荷，在电场中DNA便向正极端移动 DNA片段的电泳鉴定 PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 1.琼脂糖凝胶电泳原理 ③迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关。 ④检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。 DNA片段的电泳鉴定 2.材料用具 DNA片段的电泳鉴定 电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等 核酸染料：核酸染料在紫外光照射下发荧光。核酸染料可与DNA分子形成染料-DNA复合物，其荧光强度与DNA含量成正比。 电泳缓冲液：电泳缓冲液用来维持pH值，使DNA带负电。 凝胶载样缓冲液（含指示剂）：用于指示DNA样品可能位置 2.材料用具 DNA片段的电泳鉴定 电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等） DNA片段的扩增及电泳鉴定 配制琼脂糖溶液 DNA片段的电泳鉴定 三、方法步骤 根据待分离的DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液，琼脂糖用沸水浴或微波炉熔化，稍冷却加入适量核酸染料混匀）。 制备凝胶 加样 电泳 观察记录 核酸染料 配制琼脂糖溶液 DNA片段的电泳鉴定 三、方法步骤 制备凝胶 加样 电泳 观察记录 配制琼脂糖溶液 DNA片段的电泳鉴定 三、方法步骤 制备凝胶 加样 电泳 观察记录 ①将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 ②待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 配制琼脂糖溶液 DNA片段的电泳鉴定 三、方法步骤 制备凝胶 加样 电泳 观察记录 ③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 电泳缓冲液 配制琼脂糖溶液 DNA片段的电泳鉴定 三、方法步骤 制备凝胶 加样 电泳 观察记录 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物(marker) 凝胶载样缓冲液 PCR产物 配制琼脂糖溶液 DNA片段的电泳鉴定 三、方法步骤 制备凝胶 加样 电泳 观察记录 接通电源，根据电泳