3.2 基因工程的基本操作程序（讲义）-【金典生物】2023-2024学年高二生物下学期同步精讲系列（2019人教版选择性必修3）

3.2 基因工程的基本操作程序 1. 掌握目的基因的筛选与获取的方法。 2. 掌握基因表达载体的构建过程，限制酶的使用原则。 3. 掌握将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定的具体方法。 知识点1：目的基因的筛选与获取  考法1 PCR的原理、条件和过程  考法2 PCR的应用 知识点2：基因表达载体的构建  考法1 基因表达载体的组成  考法2 基因表达载体的构建过程  考法3 标记基因的应用 知识点3：将目的基因导入受体细胞  考法1 将目的基因导入受体细胞的方法 知识点4：目的基因的检测与鉴定  考法1 目的基因的检测与鉴定  考法2 基因工程基本操作程序的综合题 知识点5：DNA片段的扩增及电泳鉴定  考法1 DNA片段的扩增和鉴定 知识点1：目的基因的筛选与获取 ★★★ 1. 筛选合适的目的基因 （1） 目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要指 的基因，如Bt抗虫蛋白基因。 （2） 筛选方法：从相关的已知 和 清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。如培育转基因抗虫棉中用到的苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因。 【微点拨】 · Bt抗虫蛋白的杀虫机理 Bt抗虫蛋白在昆虫消化道的碱性环境下被胰蛋白酶水解，形成毒素核心肽段。毒素核心肽段能与昆虫肠上皮细胞上的受体结合，结合后插入细胞磷脂双分子层，使细胞膜允许离子（如Na+、K+等）和寡糖（如蔗糖、麦芽糖等）自由通过，细胞的渗透压发生改变，从而导致昆虫中肠停止蠕动，中肠上皮细胞解离，昆虫停止进食。芽孢在肠中萌发，经被破坏的肠壁进入血腔，大量繁殖，使昆虫患败血症，最终死亡。 但人畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此Bt抗虫蛋白不会对人畜造成危害。 2. 利用PCR获取和扩增目的基因 （1） PCR：即聚合酶链式反应，是一项根据 的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 （2） 条件 条件 在DNA复制中的作用 缓冲溶液 维持溶液的 DNA母链 提供DNA复制的 4种 . 合成DNA子链的原料 . 催化合成DNA子链 2种引物 与 相应互补序列结合，使 能够从引物的 开始连接脱氧核苷酸 【微点拨】 · 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR缓冲溶液中一般要添加Mg2+。 · 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用与PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。 · PCR的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列。 · 耐高温的DNA聚合酶——Taq DNA聚合酶。 （3） 步骤 过程 说明 图解 变性 当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链 复性 温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条DNA单链结合 延伸 72℃左右时，在耐高温的DNA聚合酶的作用下，可使DNA新链有5’端向3’端延伸 ①每次循环一般可以分为 三步。 ②第一轮循环的产物作为第二轮反应的 ，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物，如此循环多次。 【微点拨】 · 引物结合位置不在模板链端部时，第几次循环才能出现双链等长的目标DNA片段？——第3次循环。 · 目的基因的数量：目的基因的数量呈指数形式增长，扩增循环n次，DNA的数量约为2n。 · 仪器：PCR扩增仪 · PCR产物鉴定：常用琼脂糖凝胶电泳。 3. 获取目的基因的其他方法——构建基因文库 （1） 概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 （2） 种类 ① 文库：如果这个文库包含了某种生物的所有基因，那么，这种基因文库称为基因组文库。 ② 文库：如果这个文库只包含了某种生物的一部分基因，这种基因文库称为部分基因文库，例如cDNA文库。 · 取样 1. 常用方法：咽拭子、鼻拭子和肛拭子取样方法。 2. 拭子样本成分：病毒、细菌、分泌物等。 3. 样本处理方法 ①密封样本加热灭活后加入微离心管中，并在加入裂解缓冲液后，在振荡器中振荡。 ②对RNA进行提纯（以离心柱法为例）：将含目的RNA的样本加入离心柱中，加入含SiO2基质的洗涤缓冲液，在离心