备课素材：单克隆抗体的制备-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

单克隆抗体的制备 2019版高中生物学选择性必修三介绍了单克隆抗体： 单克隆抗体生产技术于1975年由Köhler和Milstein发明。作为功能分子的单克隆抗体不仅可用于基础科学，还可用于药物、测试药物、生物传感器等领域。近年来，以单抗为主的药物在中小药品销售中占主导地位，预计到2023年底，市场收入将达到2189.7亿美元左右。     单克隆抗体有两种类型：一种是识别初级蛋白结构的线性表位的抗体，另一种是识别二级、三级和更高结构的抗体。在生命科学研究中，使用识别线性表位的抗体包括ELISA和Western blot方法。然而，使用这类抗体的应用有限，而结构识别抗体有广泛的应用，如免疫沉淀，免疫染色等。 正因为，单克隆抗体有如此广泛的应用，所以，作为一名合格的科研工作者，必须了解这一技术及相关知识，所以，今天要给大家讲解的内容就是“单克隆抗体”的知识。 单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。 单克隆抗体制备的流程图 单克隆抗体制备的操作流程 1、免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。 具体操作如下： 根据抗原的特性选择合适的免疫方案，对于可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂。常用佐剂为福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状。 初次免疫，Ag50ug/只，加福氏完全佐剂皮下多点注射，一般 1.5 ml, 间隔 3 周。 第二次免疫，剂量途径同上，加福氏不完全佐剂，间隔 3 周。 第三次免疫，剂量同上，不加佐剂，腹腔注射，7 天后采血测其效价，检测免疫效果，间隔 3 周。 加强免疫，剂量 50ug，腹腔注射。 3 天后，取脾融合。 2、细胞融合 采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。 具体操作步骤如下： （1）饲养细胞的制备 在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞称为饲养细胞 小鼠腹腔巨噬细胞的准备： 用 6-10 周龄的 BALB/c 小鼠。 拉颈处死，浸泡于 75% 的酒精，消毒 3 min, 用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜。用吸管注入 6 ml 培养液，反复冲洗，吸出冲洗液。 放入 10 ml 离心管，1200rpm 离心 5 min. 用 20% 小牛血清的培养液混悬，调整细胞数为 1*105/ml. 加入 96 孔板，100ul/孔。放入 37 度孵箱培养。 （2）骨髓瘤细胞的准备 于融合前 48-36 小时，将骨髓瘤细胞扩大培养 融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于 50 ml 离心管或融合管内。 1000r/min 离心 5-10 分钟，弃去上清。 加入 30 ml 不完全培养基，离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于 10 ml 不完全培养基，混匀。 取骨髓瘤细胞悬液，加 0.4% 台酚蓝染液作活细胞计数后备用。 （3）脾细胞的准备 取已经免疫的 BALB/c 小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于 75% 酒精中 5 分钟，于培养皿上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有 10 ml 不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织。置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。，使脾细胞进入平皿中的不完全培养基。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。通常每只小鼠 1×108-2.5×108 个脾细胞。 （4） 细胞融合 将 1×10^8 脾细胞与 1×10^7 骨髓瘤细胞 SP2/0 混合于一支 50 ml 融合管中，补加不完全培养基至 30 ml，充分混匀。 1000r/min 离心 5-10 分钟，将上清尽量吸净。 在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀; 用 1 ml 吸管在 30s 内加入预热的 50% PEG1 m