专题十 习题课 课题应用 PCR中引物的设计与应用（Word教参）-【创新方案】2024年高考生物二轮复习专题辅导与测试（老教材）

课题应用　PCR中引物的设计与应用 “跨界”融会知能 一、常规PCR的原理流程及反应体系 原理 在体外模拟细胞内DNA复制的相关条件，最终完成特定基因的体外复制 流程 由变性、复性、延伸三个基本步骤完成 反应体系 ①模板：DNA；原料：dNTP；引物：P1、P2； ②耐高温的DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶； ③反应缓冲液； ④辅助因子：Mg2＋ 二、PCR中的引物 1．引物及其作用 引物 是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸 作用 在DNA复制开始时，能够使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 2．设计引物的意义及一般原则 意义 ①DNA分子体外扩增时必须设计两种引物。 ②设计引物的首要目标是其特异性，只有当每条引物都能特异性地与模板DNA中的靶序列复性形成稳定结构时才能达到这个目标(如下图) 一般原则 ①引物长度一般以20～30个核苷酸为宜，过短降低特异性，过长会引起复性时结合的模板数减少，降低反应效率。 ②要避免两个引物间碱基序列互补以及同一引物自身碱基序列互补。 ③引物5′末端碱基可添加与模板无关的序列(如限制酶的识别序列、启动子序列等)，便于克隆和表达。 ④引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。引物与核酸序列数据库的其他序列均应无明显同源性，以免造成不必要的非特异性扩增 学科网（北京）股份有限公司 3．引物的特殊应用 添加酶位点 在PCR引物的5′端加上根据需要而设计的限制酶酶切位点，PCR产物内部无该切点 反向PCR 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段即对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增(见下图) 三、PCR技术的应用 在基因工程中获取目的基因 ①扩增目的基因：从第三个循环开始出现第一个与两条引物之间的长度相同的DNA分子(含目的基因)，然后将以几何级数方式被扩增与积累。 ②优势：只需了解目的基因的上下游序列，以便设计引物对，使目的基因处于两条引物之间，即可通过PCR技术以少量生物DNA为模板获取大量目的基因，而没必要知道目的基因的全部序列 在基因水平上对蛋白质进行定点诱变改造 任何基因，只要目的基因两端及需要变异部位的序列已知，就可用PCR诱变去改造基因的序列。在需要诱变的位置合成两条带有变异基因碱基的互补引物，然后分别与目的基因上下游的两条引物进行PCR，这样得到的两个产物分别带有变异碱基，并且彼此重叠，在重叠部位经重组PCR就能得到诱变的PCR产物。该方法简便易行，准确高效，已成为常用的定位诱变方法之一 为防治疾病提供了新的手段 自PCR技术问世以来，建立于PCR技术基础上的突变基因检测技术发展迅速，它不仅能在短时间内检出发生突变的基因，而且即使获得的是极微量的组织也可经PCR扩增而进行各种检测，为疾病诊断提供新的手段 “情境”实践应用 1．流感病毒为一种RNA病毒。利用实时荧光RT—PCR技术，研制出了核酸诊断试剂盒，用于易感人群的流感病毒核酸检测。回答下列问题： 学科网（北京）股份有限公司 (1)编码流感病毒相关蛋白的基因能在人体肺部细胞中表达，其理论基础是__________________________________________________。流感病毒的RNA易被RNA酶降解，科研人员在提取RNA时往往需加入一种蛋白酶K，推测其作用是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (2)PCR技术的原理是__________。 PCR反应每次循环分为____________________三个环节，若通过PCR技术对某DNA分子扩增，至少需要______种引物。其中引物的作用是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)RT—PCR是以病毒的RNA为模板逆转录合成cDNA，并对cDNA进行PCR扩增的过程。在上述RT—PCR技术中，用到的酶有逆转录酶和________________________________________________________________________ ____________________________