备课素材：限制酶问题释疑-2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3

限制酶问题释疑 １、不同的限制酶产生的黏性末端一定不同吗？ 不同限制酶识别的碱基序列一般不同，但切割后所产生的黏性末端可能是一样的，像这种能切割不同的DNA片段但产生相同黏性末端的一类限制酶称为同尾酶。如Bgl Ⅱ和BclI，它们的识别位点分别为AGATCT和TGATCA,但能切出相同的黏性末端，如图1所示。 2、不同的限制酶识别序列一定不同吗？ 不一定。能识别相同序列的限制酶称为同裂酶，但其切割位点可能相同也可能不同。具体可分为以下几种情况： 1）同序同切酶。这些酶的DNA 识别序列和切割位置都相同，如MboⅠ与Sau 3AⅠ识别切割位 2）同序异切酶。这些酶的识别序列相同但切割位点不同，如KpnⅠ和Acc 65Ⅰ识别的序列是都GGTACC，但它们的切割位点不同，如图3所示。 3）同功多位酶。一些能识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。如EcoRⅠ识别和切割位点为G AATTC，ApoⅠ识别和切割位点为NN AATTNNN，后者可识别并切割前者的序列。 3、限制酶的DNA识别序列一定为回文序列吗？ DNA中的一段倒置重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构，这段序列被称为回文序列。其特点是在该段的碱基序列的互补链之间正读反读都相同（并非在同一条链上正读反读）。例如正读：5′GGTACC3′，反读：3′CCATGG5′。 1）回文序列：限制酶识别的序列大多数为回文序列，切割位点在DNA2 条链相对称的位置。回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为匹配黏性末端，这样形成的2个末端是相同的，也是互补的，如图4所示。 在回文对称轴上同时切割DNA的2条链，可能产生平末端，产生平末端的DNA可任意连接，但连接效率较黏性末端低，如图5所示。 2） 非对称序列有一些限制酶的识别序列是不对称的。当识别序列为非对称序列时，切割DNA产生的黏性末端是不同的，称为非对称突出端。如BbvCⅠ，它的识别切割位点见图6 。 4、限制酶的切点一定在识别序列内部吗？ 限制酶对DNA的切割位点大多数在识别序列内部，但也有在识别序列外部的，如图7所示 5、1种限制酶一定只能识别1种核苷酸序列吗？ 多数的限制酶只能识别1种特定的核苷酸序列，但也有例外,如前面所讲的同功多位酶，能够识别多种核苷酸序列，如图8所示。 6、目的基因的获取一定用到限制酶吗？ 老教材提到，获取目的基因通常有2种方法，序列已知可以用化学方法合成或者用PCR扩增目的基因，序列未知可以从基因文库中获取目的基因。 但在实际题目中往往是让学生选择用哪种限制酶去获取目的基因，容易使学生形成“目的基因的获得一定用到限制酶”这样的错误认知。在构建某种生物的基因文库时常用到限制酶，通常是将某种生物材料的遗传物质DNA用限制酶切成片段，插入到载体分子中，并将重组载体转入宿主细胞，然后再用某种探针选择、钓取目的基因。但是用化学合成法或PCR扩增目的基因过程中不一定用到限制酶，可见，目的基因的获得不一定需要限制酶。 7、构建重组DNA时一定用到限制酶吗？ 高中生物学选择性必修三提到：获得目的基因后，要将其与载体DNA连接在一起，通常是用相同的限制酶分别切割目的基因和载体DNA，然后用DNA连接酶将目的基因和载体DNA连接在一起，形成重组DNA分子。从“通常”2个字可知构建重组DNA时不一定用到限制酶，例如，利用PCR 技术获取目的基因时，通常是用耐热性DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶等)扩增目的基因序列。TaqDNA聚合酶等扩增得到PCR产物的3'端附有1个“A”碱基，可以在DNA连接酶的作用下连接到PCR产物克隆专用载体(也称为通用载体)，如pMD18-T载体。在pMD18-T载体等通用载体插入位点2侧的3‘端添加了一个“T”碱基，这样恰好可以与PCR产物末端的“A”碱基配对，得到含有目的基因序列的重组DNA分子。这种重组DNA分子可以很方便地转化到感受态细胞中，进行DNA测序以及后续的相关实验，如图9所示。 8、构建重组DNA时一定用同种限制酶吗？ 构建重组DNA时，通常是用相同的限制酶分别切割目的基因和载体DNA，这样会在目的基因和载体的两端形成相同的黏性末端，然后用DNA连接酶将目的基因和载体连接在一起，形成重组DNA分子。但是这种情况下的两两连接产物除了重组DNA分子，还有目的基因-目的基因连接产物、载体-载体连接产物。为了防止目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时常会选择不同的限制酶。 学科网（北京）股份有限公司 $$