2024届高三生物一轮复习：基因工程-基因工程的基本工具和基本操作程序

第6课时 基因工程的基本工具和基本操作程序 1.基因工程的概念 别名 技术 操作环境 生物体外 操作对象 ______ 操作水平 水平 结果 创造出更符合人们需要的新的 和__________ 重组DNA 基因 DNA分子 生物类型 生物产品 一、重组DNA技术的基本工具 2.重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”) 黏性末端 原核生物 数千 特定核苷酸序列 磷酸二酯键 限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？ 细菌的限制酶不切割自身DNA,原因是细菌细胞内自身的限制酶识别位点进行了修饰(如果DNA甲基化),或是不存在该酶的识别序列以避免被限制酶切割。 (2)DNA连接酶 磷酸二酯键 大肠杆菌 黏性末端 黏性末端 与DNA有关的几种酶的比较 归纳 提升 (3)载体 环状双链DNA分子 噬菌体 有一个至多个 自我复制 受体DNA 标记 注意    天然的质粒一般不完全具备上述条件,往往需要进行人工改造后才能用作基因工程载体。 2.质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是 A.质粒是只存在于细菌细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子 B.在所有的质粒上都能找到一个或多个限制酶切割位点 C.携带目的基因的重组质粒只有整合到宿主细胞的染色体DNA上才会随 后者的复制而复制 D.质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的鉴定和选择 √ p365 (2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶？请说明理由。 　用限制酶Ⅱ切割目的基因，用 限制酶Ⅰ切割质粒。 限制酶Ⅰ的识别序列包含限制酶Ⅱ的 识别序列，因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位点，故使用限制酶Ⅱ时，可在目的基因两端同时作切割，从而切出“目的基因”，但若使用限制酶Ⅱ切割质粒，会同时破坏质粒中的两个“标记基因”，故只能使用限制酶Ⅰ切割质粒。 限制酶Ⅰ的识别序列和切点 限制酶Ⅱ的识别序列和切点 延伸 应用 图解限制酶的选择原则 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 延伸 应用 (3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 1.DNA的粗提取与鉴定 (1)基本原理 不溶于 2 mol/L 二苯 胺 二、DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定 (2)操作流程 95% 沸水 1.过滤时应选用纱布而不是滤纸,如果用滤纸可能会把DNA分子吸附在滤纸上。 2.低温操作能防止DNA酶降解DNA。 3.粗提取的DNA可能含有核蛋白、多糖等杂质。 2.PCR 和扩增目的基因 a.PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据 的原理，在体外提供参与DNA复制的各种 与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行 的技术。 b.PCR反应的条件：一定的 、DNA模板、2种 、4种______ 、 DNA聚合酶，以及能自动调控 的仪器。 获取 DNA半保留复制 组分 大量复制 缓冲溶液 引物 脱氧 核苷酸 耐高温的 温度 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR缓冲溶液中一般要添加Mg2+。 c.PCR扩增的过程 90 单链 50 引物 72 由图可知,理论上通过三次循环可以得到目的基因。 PCR的结果 (1)合成DNA的数量:a×2n(a:初始数量;n:循环的次数)。 (2)合成目的基因的数量:a×(2n-2n)。 思考　PCR可以扩增mRNA吗? mRNA不可以直接扩增,需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。 （3）PCR产物的鉴定：常采用 来鉴定。 琼脂糖凝胶电泳 知识拓展   引物的选择原则 1.引物长度适宜、适量的CG含量(保证有较高的复性温度)、引物自身及引物之间不存在互补配对、引物的3'端必须和DNA模板严格互补配对,5'端不需要与DNA模板严格互补配对,5'端可以修饰。 5'端修饰方法 作用 加入限制酶酶切位点 可以利用