二轮微专题：基因定点突变和基因编辑

基因定点突变： 1.重叠延伸PCR：是一项重要的基因定点突变技术，其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物（图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点），分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺（密码子为AAC、AAU）替换为赖氨酸（密码子为AAA、AAG），从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。 1.该过程需要___种引物； 2.PCR1的产物AB是引物___和引物___扩增的结果； 3.PCR2的产物CD是引物___和引物___扩增的结果； 4.产物AD的形成需要引物吗？ 5.需要改变的碱基位于引物___和引物___上 6.引物b和引物c之间有什么关系？_________________ 7.PCR3中突变产物AD的扩增需要引物___和引物___ 4 a b c d b c 引物b和引物c应有部分碱基互补 a d 不需要，需要耐高温的DNA聚合酶 8.PCR1中至少第___次才能获得产物AB； 9.PCR2中至少第___次才能获得产物CD； 10.过程①的条件为： ________________________ 11.AB下链和CD上链结合能得到产物AD吗？__________________ 不能，DNA聚合酶只能将游离的脱氧核苷酸连接在已有链的3’端(即新链的延伸只能从5’端到3’端） 3 3 先加热至90-95℃再冷却至55-60℃ 2.大引物PCR：需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。该技术的流程如图3-10所示。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。 补充：基因的定点突变技术3 1.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引（注：引物的作用是与模板链形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸），两种引物及其与模板链的结合位置如图甲所示。经4轮循环后产物中有5种不同的DNA分子，如图乙所示，其中第⑤种DNA分子有（　　） 解析：A　第⑤种DNA分子是两条链等长的DNA分子，PCR扩增时，若引物的结合位点位于DNA分子的内部，则经过n次循环后得到的两条链等长的DNA分子的数量为2n－2n。因此，经4轮循环后，第⑤种DNA分子有24－2×4＝8个。 A.8个 B.6个 C.4个 D.2个 2.某科研小组从土壤菌株A、B中分离到同源性为93%的Bt1抗虫基因和Bt2抗虫基因的编码序列，并运用交错延伸PCR技术获得了抗虫性能强的重组Bt基因，转入烟草获得成功，过程如图所示。 注：①交错延伸PCR：基因Bt1和Bt2均作为模板，所需引物相同，图中仅示其中一条链的延伸情况。 ②EcoRⅠ限制酶的识别序列及切割位点⁠ ③启动子Prla可在烟草叶肉细胞中特异性启动基因的转录。④图中生长素合成酶基因是通过成熟mRNA逆转录获得的cDNA片段，可使植物细胞合成生长素。 ⑤抗草甘膦基因（oroA）正常表达可使植物对除草剂草甘膦有较好抗性；抗卡那霉素基因（Kanr）正常表达可使细菌对卡那霉素有较好抗性。 （1）若用EcoRⅠ和限制酶XmaⅠ（ ）双酶切多个目的基因，随机连接 　　⁠（填“能”或“不能”）避免两个目的基因连接成环。图中所示Ti质粒部分至少含有 　　⁠个启动子，复制原点是 　　　⁠酶识别和结合的位点。  （2）在培养愈伤组织的培养基中添加 　　　　　　⁠可以筛选含有Bt重组基因的细胞。图中生长素合成酶基因是否能促进愈伤组织生根？作出判断并解释：  （3）已知交错延伸PCR中所用引物片段均为30个核苷酸，Taq DNA聚合酶在72 ℃下的扩增速度为1 000 个碱基/min，本实验的循环扩增条件为：95 ℃变性30 s，50 ℃复性15 s，72 ℃延伸15 s，共80个循环。第二轮循环后所得重组型子链长度为 　　　⁠个核苷酸。若将复性温度调成55 ℃，则无法得到扩增产物，原因是 　　　　　　　　　　　　⁠。通过交错延伸PCR获得的重组Bt基因，同时具有Bt1和Bt2基因序列的原因是 　　　　。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 答案：答案：（1）不能　3　解旋 （2）草甘膦　不能，因为生长素合成酶基因是通过成熟mRNA逆转录获得的编码区序列，自身无启动子，而启动子Prla在愈伤