第10章 高效液相色谱法（课件）- 《分析化学》同步教学（海洋大学版）

第 10 章 高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography, HPLC 液体溶剂作为流动相 的色谱方法 §10.1 高效液相色谱概述 §10.2 高效液相色谱仪 （重点） 高压输液装置；进样系统；分离系统；检测系统；辅助系统 §10.3 高效液相色谱的各类方法（重点） 分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱（离子色谱）、尺寸排 阻色谱或凝胶色谱 本章内容 早 期 液 相 色 谱 ， 包括 Tswett 的 工 作 ， 都 是 在 直 径 1~5cm, 长 50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固 定相颗粒直径多在150~200μm范围内。即使这样，流速仍然很低 (<1mL/min) ，分析时间仍然很长！ 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：有效地增加柱效的 方法是减小填充物的粒径（3~10μm ）。 当加压增加流速（真空或空气泵） 时，尽管分析时间减少，但柱 塔板高度H最小也相应增加了，或者说柱效降低了。 §10.1 高效液相色谱概述 一、高效液相色谱法的特性 特点：高压、高速、高效、高灵敏（与经典LC相比） .高压、高速：HPLC采用高压输液， 流速大增，分析速度极快，只需数分 钟；而经典方法靠重力加料，完成一 次分析需时数小时。 .高效：填充物颗粒极细且规则， 固 定相涂渍均匀、传质阻力小， 因而柱 效很高。可以在数分钟内完成数百种 物质的分离。 .高灵敏度： 目前检测器灵敏度极高 UV检测器：10-9g；荧光检测器： 10-11g。 §10.1 高效液相色谱概述 .分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这 些物质只占有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的 稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。 • GC: b.p. < 500 ，M < 400 ，thermal stable • HPLC： b.p. > 500 ，M > 400 .流动相的差异：GC采用的流动相为有限的几种“惰性 ”气体，只 起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体 的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用， 并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可 通过溶剂来控制和改进分离。 .操作温度的差异： GC需高温；HPLC通常在室温下进行。 §10.1 高效液相色谱概述 二、 HPLC和GC的对比 三、 HPLC的特殊性（与GC相比） 影响HPLC柱效的因素同样为涡流扩散、分子扩散及传质阻力 三项。但分子在液体中的扩散系数要比在气体中的小4～5个数量 级 ，会产生什么结果？ 1、纵向扩散对色谱峰扩展影响很小 流动相的线速率>0.5 cm·s-1 ，分子纵向扩散项的影响可以忽略， 液相色谱中H-u曲线中的最佳流速值比气相色谱小得多。 §10.1 高效液相色谱概述 2、传质速率慢 • 固定相的微孔小且深时，扩散不易进行，传质速率慢，对色谱峰 的扩展影响较大。 • 固定相颗粒越小，传质过程越快， 柱效越高； • 减小固定相的颗粒粒度和减少孔穴深度是提高柱效的最有效手段。 • 现代高效液相色谱的柱填料粒径都小于10μm。 与GC 不同： 分子纵向 扩散项可忽略，影响柱 效的主要因素是传质阻 力项。 三、 HPLC的特殊性（与GC相比） 不同粒径的ODS填料对液相色谱H-u曲线影响 3、柱外效应影响显著峰展宽 柱外因素： 柱前峰展宽和柱后峰展宽 • 柱前峰展宽： 由进样及进样器到色谱柱连接管引起的 柱头直接进样，色谱峰的不对称性和柱效有明显改善 • 柱后峰展宽：柱后连接管和检测器死体积； 通用紫外检测器的池体积仅为8μL。 三、 HPLC的特殊性（与GC相比） HPLC工作流程及组成： . 高压输液系统 . 进样系统 . 分离系统 . 检测系统 此外，还配有辅助系统 （梯度淋洗装置、自动进 样装置和数据处理装置） 。 §10.2 高效液相色谱仪 一、高压输液系统（包括四部分）： 1 、贮液器： 1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器，其孔很小约2μm， 可防止颗粒物进入泵内。 2 、脱气：超声波脱气、真空加热脱气和He脱气。 3、高压泵： 输送流动相 要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀 种类：恒压型和恒流型 .恒压泵（气动泵） 可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因 泵腔体积大，在往复推动时