第十七章 毛细管电泳法（课件）- 《分析化学》第二课时同步教学（人卫版第9版）

第四节 毛细管电泳仪 1.高压电极槽和进样机构 2.填灌清洗机构 3.毛细管 4.检测器 5.铂丝电极 6.低压电极槽 7.恒温系统 8.数据记录处理系统 仪器分析 毛细管电泳法 对CE的要求： ▲进样机构不存在死体积，能进行精确的进样控制。 ▲需有毛细管清洗机构。 ▲高压电源至少应能输出200μA×25kV的功率。 ▲检测器尽量安装在接地端，优先考虑柱上紫外检测方式。 ▲ 温控范围宽，以0 ℃为界，越宽越好，上限不应低于50 ℃ ，最好能达到65～70 ℃ ，至少能在20～40℃内恒温，恒温精度应小于±0.2 ℃ 。 仪器分析 毛细管电泳法 高压电源一般采用（0~±30）kV连续可调的直流高压电源，电压输出精度应高于1%。电极通常由直径0.5mm~1mm的铂丝制成。电极槽通常是带螺帽的玻璃瓶或塑料瓶（1ml~5ml不等），以便于密封。 仪器必须接地，操作过程中必须注意高压的安全保护。 一、高压电源 仪器分析 毛细管电泳法 二、毛细管 1.尺寸 毛细管尺寸的选择与分离模式和样品有关。自由溶液电泳多选用50或75μm内径的毛细管，分离的有效长度常控制在40～100cm之间。如进行大颗粒如红细胞的分离，则需要内径大于 300μm的毛细管。CGE或CEC的有效长度一般控制在20cm左右。 2.涂层 一般不需涂层处理。大分子化合物分离时，常常需要惰性管壁，以抑制吸附。做CIEF或CGE时，需要涂层毛细管以抑制电渗。在分离中，有时为了加强电渗或改变其方向，也需要涂层毛细管。 仪器分析 毛细管电泳法 3. 清洗 毛细管在使用过程可能被污染，从而影响分析的结果。为使测定具有良好的重现性，毛细管在使用时应经常清洗。 ▲空管通常用 0.l～1mol/L NaOH、水和缓冲液顺序冲洗，各洗5~10min，或增加有机溶剂如甲醇清洗步骤，以除去管中的脂溶性吸附组分。如果怀疑管内壁吸附有蛋白质或其他有机分子，可用0.l～1mol/L的HNO3洗 5～10min，然后再按常规清洗。 ▲两次分析之间，可用运行缓冲液清洗、平衡。 仪器分析 毛细管电泳法 三、进样系统 毛细管通道十分细小，所需样品不过数nl，所以不能采用色谱的进样方式。通过让毛细管与样品溶液直接接触，然后由重力、电场力或其它动力来驱动样品进入管中。进样量可以通过控制驱动力的大小或时间长短来控制。进样系统必须包括动力控制、计时控制、电极槽或毛细管移位控制等机构。 进样方式：  电动法  压力法  扩散法 仪器分析 毛细管电泳法 电动进样 当把毛细管的进样端插入样品溶液并加上电场时，组分就会因电迁移和电渗作用而进入管内。 电动进样的控制参数是电场强度E和进样时间t。电场强度E取值多在1～60kv/60cm 之间；进样时间通常在1～10s 之间，有时可达1min或更大。 优点：电动进样对毛细管内的填充介质没有特殊限制，属普适性方法，可实现自动化操作。 缺点：电动进样对离子组分存在偏向，电迁移速度快的进样多，电迁移速度小的少进甚至不进，这会降低分析的准确性和可靠性。 仪器分析 毛细管电泳法 压力进样 也称流动进样，它要求毛细管中的填充介质具有流动性。当毛细管两端置于不同的压力环境中时，管中溶液即能流动，将样品带入。 可用三种方法产生进样动力：正压、负压（管尾抽吸）、重力（虹吸）。 采用压缩空气（气体钢瓶）可实现正压进样，并可与毛细管清洗系统共用，多为商品仪器采用。 优点：压力进样没有偏向问题， 缺点：选择性差，样品及其背景同时被引入 管中，对后续分离可能产生影响。 仪器分析 毛细管电泳法 扩散进样 利用浓度差扩散原理，当将毛细管插入样品溶液时，样品分子因在管口界面存在浓度差而向管内扩散。扩散进样动力属不可控制参数，进样量仅由扩散时间控制。对于利用电动和压力进样的系统，设置电场或压力差为零，即可实现扩散进样。扩散进样时间一般在10～60s。扩散进样对管内介质没有任何限制，属普适性进样方法。 扩散进样具有双向性，在样品分子进入毛细管的同时，区带中的背景物质也向管外扩散，由此可得到畸变程度较小（和背景差别不大）的初始区带，能抑制背景干扰，提高分辨率。扩散与电迁移速度和方向无关，可抑制进样偏向，提高定性定量的可靠性。 仪器分析 毛细管电泳法 四. 检测器 在毛细管电泳中，毛细管柱内径小（通常50μm或75μm)，区带体积小，仅为nl级，区带迁移速度快，这就对检测器提出了很高的要求。 毛细管电泳要求检测方法必须具有很高的灵敏度和很快的相应速度，且不能引起区带扩张。 常用柱上检测法 仪器分析 毛细管电泳法 紫外检测 由于紫外