第十七章 毛细管电泳法（课件）- 《分析化学》第一课时同步教学（人卫版第9版）

概述 电泳（Electrophoresis)是指溶液中带电粒子在电场的作用下向与自身带相反电荷的电极移动的现象。将电泳发展成为分离技术应归功于Tiselius的工作。他于1937年建立“移界电泳（moving boundary electrophoresis)”，成功地将人血清中的蛋白质分为白蛋白、α、β、和γ球蛋白，这项工作成为蛋白质化学发展的基础，因此Tiselius本人荣获1948年诺贝尔化学奖。 仪器分析 毛细管电泳法 高效毛细管电泳 经典电泳法散热差，分离电压受到限制。 1981年，Jorgenson和Lukacs发表了在毛细管电泳发展史上具有划时代意义的工作，他们采用75μm内径的石英毛细管做为分离室，紫外柱上检测的方法，在30kv的分离电压下分离丹酰化氨基酸，柱效达到40万个理论塔板。他们的工作为毛细管电泳的发展奠定了基础。 James W. Jorgenson North Illinois University 化学系教授 仪器分析 毛细管电泳法 仪器分析 毛细管电泳法 基本理论 一. 电渗 电渗（electroosmosis)是毛细管电泳分离理论中最基本的概念之一。 电渗是指在电场作用下，毛细管中或固相多孔物质内，液体沿固体表面移动的现象。电渗与固液两相界面的双电层有着密切关系。 电渗速度uos以下式表示： 仪器分析 毛细管电泳法 石英毛细管壁上的硅羟基在水溶液中发生电离，所产生的SiO-负离子使毛细管壁带负电荷。溶液中的抗衡离子靠静电吸附和分子扩散在固液界面上形成双电层（electric double layer)，双电层包括紧密层和扩散层。 仪器分析 毛细管电泳法 HPLC由于压差产生抛物线型的流体流速轮廓。电渗流的流速轮廓是一个平面，在毛细管中如同瓶塞一样流动，不存在径向的流速梯度。这是毛细管电泳分离柱效高于HPLC的原因之一。 在电场作用下，固液两相间的相对运动发生在紧密层与扩散层之间的滑动面上。 由于离子的溶剂化作用，当形成扩散层的离子在电场中移动时，携带着液体一同移动，因此产生电渗流（electroosmotic flow,EOF） 仪器分析 毛细管电泳法 缓冲液pH对电渗流的影响 随着pH的增大，石英管壁表面的硅羟基解离度增加，界面有效电荷密度增大，EOF随之增大。 阳离子型的表面活性剂使电渗流发生反转 a.无表面活性剂存在；b．阳离子表面活性剂在毛细管壁表面的吸附，抵消了原来的负电荷，使电渗迁移率0；c.继续增大阳离子表面活性剂的浓度，阳离子表面活性剂分子通过非极性链疏水相互作用，在毛细管柱表面形成双分子层，使电渗流反转. 在缓冲液中加入有机添加剂，如甲醇、异丙醇等，或水溶性高分子物质，对EOF也有较显著的抑制作用。 仪器分析 毛细管电泳法 电泳（electrophoresis）是指溶液中带电粒子（离子）在电场中定向移动的现象。 电泳迁移速度 uep 为： 式中 －电泳迁移率（电泳淌度） （electrophoresis mobility)（m2/V.s） V－毛细管柱两端施加的电压, L－毛细管柱长 二 . 电泳 △在空心毛细管中一个粒子的淌度可近似表示为： 　　 仪器分析 毛细管电泳法 三、表观淌度 表观淌度 表观迁移速度 正离子 μeff+μos ueff+ uos 中性分子 μos uos 负离子 μeff-μos ueff - uos 由于电渗流速度大大高于电泳速度，所以，不管正离子、负离子还是中性分子，均随电渗流移动。 仪器分析 毛细管电泳法 物质在毛细管中的保留时间为： Ld为毛细管柱进样端至检测窗口的距离（有效长度） 四、分离效率和谱带展宽 （一）理论板数和板高 仪器分析 毛细管电泳法 毛细管电泳分离柱效方程 从分离柱效方程可知： （1）分离电压V↑, n↑ （2）V一定时，Ld/L ↑, n↑ （3）扩散系数D↓, n↑；大分子的D小，故CE对大分子分离柱效高。 仪器分析 毛细管电泳法 （二）引起区带展宽的因素 分子扩散 焦耳热 电流通过毛细管中的电解质溶液时会 产生焦耳热，使毛细管内及周围温度分布。 由于毛细管柱中沿径向存在一个抛物线型的温度梯度，由此引起介质的粘度在径向上的梯度分布，进而引起径向上的电泳速度梯度。 仪器分析 毛细管电泳法 3.吸附 产生原因： （1）阳离子溶质和带负电的管壁的离子相互作用 （2）疏水作用。 对