第9章 实验14 水中大肠菌群的测定(课件）-《环境监测》同步教学（科学出版社）

水中总大肠菌群的测定 －多管发酵法 实验十四 一、实验目的 (1)掌握多管发酵法测定水中总大肠菌群的技术。 (2)掌握培养基制备、微生物接种基本操作技术。 二、实验原理 总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。多管发酵法的原理是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。试验结果以最可能数(most probable number)，简称MPN表示。 三、仪器及试剂 (一) 仪器 高压蒸气灭菌锅、恒温培养箱、冰箱、生物显微镜、载玻片、酒精灯、镍铬丝接种棒、培养皿(直径100mm)、试管(5×150mm)、移液管(1、5、10mL)、烧杯(200、500、2000mL)、.锥形瓶(500、1000mL)、采样瓶等。 (二)试剂 1.乳糖蛋白胨培养液 2.三倍浓缩乳糖蛋白陈培养液 3.品红亚硫酸钠培养基 4.伊红美蓝培养基等 四、实验步骤 (一)生活饮用水 (1)初发酵试验。在两个装有已灭菌的50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大试管或烧瓶中(内有倒管)，以无菌操作各加入已充分混匀的水样100mL。在10支装有已灭菌的5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中(内有倒管)，以无菌操作加入充分混匀的水样10mL，混匀后置于37℃恒温箱内培养24h。 (2)平板分离。上述各发酵管经培养24h后，将产酸、产气及只产酸的发酵管分别接种于伊红美蓝培养基或品红亚硫酸钠培养基上，置于37℃恒温箱内培养24h，挑选符合下列特征的菌落。 ①伊红美蓝培养基上：深紫黑色，具有金属光泽的菌落；紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色，中心色较深的菌落。 ②品红亚硫酸钠培养基上：紫红色，具有金属光泽的菌落；深红色，不带或略带金属光泽的菌落；淡红色，中心色较深的菌落。 (3)取有上述特征的群落进行革兰氏染色 。 (4)复发酵试验。上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另一部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中(内有倒管)，每管可接种分离自同一初发酵管(瓶)的最典型菌落1～3个，然后置于37℃恒温箱中培养24h，有产酸、产气者(不论倒管内气体多少皆作为产气论)，即证实有大肠菌群存在。根据证实有大肠菌群存在的阳性管(瓶)数查教材表9.8“大肠菌群检数表”，报告每升水样中的大肠菌群数。 (二)水源水 (1)于各装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5个试管中(内有倒管)，分别加入10mL水样；于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中(内有倒管)，分别加入1mL水样；再于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中(内有倒管)，分别加入1mL1:10稀释的水样。共计15管，三个稀释度。将各管充分混匀，置于37℃恒温箱内培养24h。 (2)平板分离和复发酵试验的检验步骤同“生活饮用水检验方法”。 (3)根据证实总大肠菌群存在的阳性管数，查后表9.9“最可能数(MPN)表”，即求得每100mL水样中存在的总大肠菌群数。我国目前系以1L为报告单位，故MPN值再乘以10，即为1L水样中的总大肠菌群数。 对污染严重的地表水和废水，初发酵试验的接种水样应作1:10、1:100、1:1000或更高倍数的稀释，检验步骤同“水源水”检验方法。 如果接种的水样量不是10mL、1mL和0.1mL，而是较低或较高的三个浓度的水样量，也可查表求得MPN指数，再按下式换算成每100mL的MPN值。 五、注意事项 (1)实验过程应保持无菌操作。 (2)注意高压灭菌锅的安全使用。 (3) 要注意控制革兰氏染色的时间，特别是脱色时间。 思考题 1.革兰氏染色有哪些主要步骤？ 2.水中大肠胃菌群检测的意义。 $$