第三部分 第十四章 荧光分析法（课件）- 《分析化学实验》同步教学（华中科技大学版）

第三部分 仪器分析实验 第十四章 荧光分析法 1 实验一 荧光法测定维生素B2的含量 【实验目的】 1.掌握标准曲线法定量分析维生素B2的基本原理。 2.了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能，掌握其基本操作。 3.掌握实际样品中维生素B2的测定。 【实验原理】 荧光是一种光致发光，任何荧光物质都具有激发光谱和发射光谱,发射波长总是大于激发波长。荧光激发光谱是通过测定荧光体的发光通量随波长变化而获得的光谱，反映不同波长激发光引起荧光的相对效率。荧光发射光谱是当荧光物质在固定的激发光源照射后所产生的分子荧光，是荧光强度对发射波长的关系曲线，表示在所发射的荧光中各种波长相对强度。由于各种不同的荧光物质有它们各自特定的荧光发射波长，可用它来鉴定荧光物质。有些发荧光的物质其荧光强度与物质的浓度成正比，故可用荧光分光光度法测定其含量。 【实验原理】 维生素B2在430-440nm蓝光照射下，发出绿色荧光，荧光峰在525nm左右。在pH＝6-7的溶液中荧光强度最大，而且其荧光强度与维生素B2溶液浓度呈线性关系，因此可以用荧光光谱法测维生素B2的含量。维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为另一物质-光黄素，光黄素也是一个能发荧光的物质，其荧光比维生素B2的荧光强得多，故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。 在稀溶液中，荧光强度F与物质的浓度c有以下关系：F＝2.303ФI0εbc F为荧光强度，I0为入射光的光强，Ф为荧光量子产率，ε为摩尔吸光系数，b为样品溶液的光程(即样品池的厚度)，c为样品的摩尔浓度。 当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度呈线性：F = Kc 【仪器和试剂】 仪器：荧光分光光度计、pH计、电子天平、1cm荧光专用石英比色皿、50mL、100mL容量瓶 试剂：维生素B2标准溶液（10.0 μg/mL）、醋酸、盐酸、硼酸、磷酸、氢氧化钠、商品化维生素B2片剂 以及复合维生素片剂。 【实验内容】 1.维生素B2标准储备液（10μg/mL）的配制 将维生素B2标准品置于真空干燥箱或装有五氧化二磷的干燥器中干燥处理24小时后，准确称取10 mg（精确至0.1 mg）维生素B2标准品，加入2mL1%的醋酸溶液或盐酸溶液（1+1）超声溶解后，立即用水转移并定容至1000 mL。混匀后转移至棕色玻璃容器中，储存于4℃冰箱中。 2.系列标准溶液和待测溶液的配制 维生素B2（10.0μg/mL）标准溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL分别置于50mL的棕色容量瓶中，标定，摇匀。 3.激发光谱和荧光发射光谱的绘制（用5.00mL的标准溶液） 设置λEm=525nm为发射波长，在250-400范围内扫描，记录发射波长强度和激发波长关系曲线，得激发光谱。记录最大激发波长,设置λEx最大激发波长即450nm，在460-700nm范围内扫描，记录发射强度与发射波长间函数关系，得荧光发射光谱, 找出其最强的荧光强度，相对应的波长即为最佳发射波长λEm。 。 4.不同pH对维生素B2荧光的影响 配制不同pH的B-R缓冲溶液，取等量的维生素B2加入不同pH的缓冲溶液中，在EX=450nm，EM=525nm处测定不同pH对维生素B2荧光影响，绘制曲线图。 5.标准溶液及样品的荧光测定 将激发波长固定在450nm，荧光发射波长为525nm，测量上述系列标准溶液的荧光发射强度，按浓度从低到高测定。 6.溶解样品的处理 避光条件下，称取含维生素B2的片剂一片的质量。为获得样品中维生素B2平均含量。将5-6片样品研磨，然后再次研磨均匀的粉末称取一片的质量。将其溶解于50mL1%醋酸溶液，超声5-10分钟使其溶解，5000转离心10分钟，弃沉淀，定容至100mL容量瓶，避光备用。 以上溶液稀释100倍，同样条件下测定未知溶液荧光强度，由标准曲线确定未知试样中维生素B2浓度。 7.数据处理 激发波长λEx=450nm 荧光发射波长λEm=525nm 标准溶液剂待测溶液的浓度和荧光强度记录，可得待测溶液的浓度。 维生素B2溶液浓度（μg/mL） 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 待测溶液 相对荧光强度 【注意事项】 1.石英皿是四面透光的，拿的时候不能接触到四个透光面，只能拿上下角部，擦外壁残留液时由于擦镜纸不吸水，故可先用吸水纸巾擦干，再用擦镜纸擦。 2.实验所得到标准取线的R值，而理论R值为1，相关度是否接近，如接近说明准确