第三部分 第十九章 高效液相色谱法（课件）- 《分析化学实验》同步教学（华中科技大学版）

第三部分 仪器分析实验 第十九章 高效液相色谱法 1 实验一 高效液相色谱仪的性能检查和色谱参数测定 【实验目的】 1. 掌握柱效的测定原理和方法。 2. 掌握高效液相色谱仪的使用方法。 3. 熟悉高效液相色谱仪性能检查和色谱参数测定的方法。 【实验原理】 高效液相色谱仪的主要性能指标包括： （1） 流量精度：色谱仪流量的重复性，用多次测定的流量值的相对标准偏差表示。 （2） 噪声：由于仪器本身和工作条件等的偶然因素引起的基线起伏称为噪声。噪声的大小用基线波动的最大带宽来衡量，通常以毫伏或安培为单位。 （3） 漂移：基线在单位时间内单方向缓慢变化的幅度。单位为mV/h。 （4） 定性重复性：在同一实验条件下，组分保留时间的重复性。通常以被分离组分的保留时间之差（a）的相对标准偏差来表示，RSD≤1%认为合格。 （5） 定量重复性：在同一实验条件下，被测组分峰面积的重复性。通常用峰面积的相对标准偏差表示。 （6） 定量重复性：在同一实验条件下，色谱峰面积（或峰高）的重复性。通常以被分离组分的峰面积比的相对标准差来表示，RSD≤2%认为合格。 高效液相色谱参数包括定性参数、定量参数、柱效参数和分离参数。 本实验主要测定下列色谱参数： 理论板数： 理论板高: 有效塔板数： 保留因子: 分配系数比（分离因子）: 分离度： 上述各式中为保留时间，W（1/2）为半峰宽，L为柱长，tR′为调整保留时 间，t0为死时间，K为分配系数，Vs为柱内固定相体积，Vm为柱内流动相体积，W为峰宽。 【实验内容】 色谱条件：ODS柱（15 cm×46 mm，5 m）；流动相：甲醇-水（80:20）； 流速：0.8 mL/min；检测器：UV 254 mm 实验过程： 1. 制备流动相：甲醇、重蒸水进行过滤和脱气。 2. 安装流动相，开机预热至基线平稳。 3. 流量精度的测定 （1） 按色谱条件，在指示流量1.0 mL/min、2.0 mL/min、3.0 mL/min三点测定流量。用10 mL量瓶在流动相出口处接收流出液。用秒表准确记录流出10 mL所需的时间，换算成流速（mL/min），重复测定5次（按下表记录）。 （2） 给出结论（合格或不合格）。 指示流量 1.0 ml/min 2.0 ml/min 3.0 ml/min 测得流量 t/10 mL mL/min t/10 mL mL/min t/10 mL mL/min 1             2             3             4             5             平均值             RSD（%）             4. 基线稳定性（噪声和漂移）的测定 仪器稳定后将检测器灵敏度放在较高挡（至能测出噪声），记录基线1h。测定基线峰对谷（负峰）的最大宽度为噪声。基线带中心的结尾位置与起始位置之差为漂移。 5. 重复性的测定 （1） 试样：甲苯（1 g/L）、萘（0.05 g/L）及苯磺酸钠（0.02 g/L，用于测定死时间t0）的甲醇（或流动相）溶液。 （2） 进样20 L，按色谱条件记录色谱图，测定t0、甲苯和萘的tR、W1/2、A等。重复测定5次（按下表记录有关数据）。 （3） 以保留时间和峰面积分别计算仪器的定性、定量重复性。 6. 色谱参数的测定 上述测得数据计算理论板数、理论板高、有效板数、保留因子、分配系数比和分离度   1 2 3 4 5 平均值 SD RSD（%） t0                 tR（苯）                 tR（萘）                  tR                 A甲苯或h甲苯                 A萘或h萘                 W1/2（甲苯）                 W1/2（萘）                 A甲苯/A萘                 或h甲苯/h萘                 【注意事项】 1. 计算板数和分离度时，应注意tR和W1/2单位一致。 2. 输液泵使用注意事项: （1） 防止任何固体微粒进入泵体。 （2） 流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲盐的流动相不应长时间保留在泵内。 （3） 工作时要防止溶剂瓶内的流动相被用完。 （4） 输液泵工作压力不要超过规定的最高压力。 （5） 流动相应该