14 荧光分析法（课件）- 《分析化学》同步教学（华中科大版）

第十四章 荧光分析法 1 2.熟悉 熟悉分子从激发态返回基态的各种途径；分子结构与荧光的关系；影响荧光强度的因素。 3.了解 了解荧光分光光度计；荧光分析的相关技术及其应用。 掌握荧光分析法的基本原理；涉及分子荧光的发生过程；激发光谱和发射光谱；荧光光谱的特征。荧光分析的定量分析方法。 1.掌握 章节目标 什么是荧光？ 当某物质吸收特定波长的光之后，除产生吸收光谱之外，还会发射出比原来吸收波长更长的光，当激发光停止照射之后，这种光线也随之很快地消失，这种光就称之为荧光。 外界提供能量的方式有多种，如光照、加热、化学反应及生物代谢等。通过光照激发产生的荧光称为光致荧光。 1575年，西班牙医生N.Monardes发现。 1852年，Sir George Stokes对荧光产生的机理作了解释，并提出了“荧光”。 1867年，首次用于分析测定。 1928年，Jette和West提出第一台光电荧光计。 1952年，商品荧光分光光度计出现。 当特定波长的激发光照射到某些物质的时候，这些物质除了能对光选择性吸收产生吸收光谱外，还会发射出比原吸收波长更长的光，当激发光停止照射，所发射的光线也很快随之消失，这种光称为荧光。(fluorescence)，荧光是物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最低振动能级返回基态时发射出的光。 荧光 第一节 荧光分析法的基本原理 发射荧光的微粒 分子荧光 原子荧光 激发光波长 Ｘ射线荧光 紫外可见荧光 红外荧光 荧光分析法的优点： 灵敏度高。较吸收光度法一般要高2 ~ 3个数量级。 选择性高。物质对光的吸收具有普遍性，但吸光后并非都有发光。即便都有发光现象，但在吸收波长和发射波长方面不尽相同，这样就有可能通过调节激发波长和发射波长来达到选择性测定的目的。 试样用量小，操作简便。 工作曲线的动态线性范围宽。 能提供较的多分析参数、信息量大。 发光分析法在光学分子传感器以及在生物医学、药学和环境科学等方面的应用更显示了它的优越性。 一、分子荧光 （一）分子荧光的产生 图14-1 单线态及激发三线态示意图 a.基态单线态（π） b.激发单线态（ππ*）c.激发三线态（ππ*） 第一节 荧光分析法的基本原理 S*2 S*1 S0 T*1 吸 收 发 射 荧 光 发 射 磷 光 体系间跨越 内转换 振动弛豫 能 量 l 2 l 1 l 3 外转换 l 2 内转换 振动弛豫 图 14-2 荧光和磷光能级示意图 a.吸收 b.振动弛豫 c.内转换 d.荧光 e.外转换 f.体系间跨越 g.磷光 1．振动弛豫(vibrational relexation) 由于分子间的碰撞，处于激发态各振动能级的分子可以将能量以热的形式传递给其它分子，同时自身从Sn的较高振动能级回到Sn的最低振动能级上，这一过程称为振动弛豫。 振动弛豫只能在同一电子能级内进行，发生振动弛豫的时间为10-12 s数量级。 图14-2中各振动能级间的小箭头表示振动弛豫的情况。 由于能量不是以光辐射的形式放出，故振动弛豫属于无辐射跃迁。 溶液中由分子碰撞所引起的振动弛豫发生率很高。 2．内部能量转换(internalconversion)简称内转换，属于无辐射跃迁，是与荧光相竞争的过程之一。当两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至较低能级的电子激发态。 通过内转换和振动弛豫，高激发单线态的电子跃回第一激发单线态的最低振动能级。即激发态分子将多余的能量转变为热能，从较高电子能级降至较低的电子能级。 3．荧光发射(fluorescence emission) 无论分子最初处于哪一个激发单线态，通过内转换及振动弛豫，均可返回到第一激发单重态的最低振动能级。而当分子处于单线激发态的最低振动能级时，会在10-9 ~10-7 s左右的时间内，以辐射形式发射光量子释放能量，返回基态的任一振动能级，这一过程称为荧光发射。 4．外部能量转换(external conversion)简称外转换，是与荧光相竞争的主要过程。指的是处于激发态的分子通过与与溶剂或其它溶质分子间的相互作用和能量转移而使荧光强度减弱甚至消失的过程。这一现象也称为荧光熄灭或荧光淬灭。从第一激发单线态或三线态回到基态的无辐射跃迁类型(图14-2)既有内转换也有外转换。 5.体系间跨越(intersystem crossing)是指不同多线态间的无辐射跃迁。涉及受激电子自旋状态的改变，是处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程。如图14-2，激发单线态的S*1最低振动能级同三线态的较高振动能级T*1重叠，电子自旋状态改变的体系间跨越就有发生的可能。分子由激发单线态跨越到激发三线态后，荧光强度减弱甚