第十五章 高效液相色谱法（课件）- 《分析化学》高效液相色谱仪同步教学（人卫版第9版）

高效液相色谱仪 进样系统 02 分离系统 03 检测系统 04 数据记录与处理系统 05 输液系统 01 高效液相色谱仪 高效液相色谱仪 一些商品化仪器 检测器 柱温箱 样品盘 控温箱 流动相 脱气装置 四元泵 高效液相色谱仪 4 HPLC 仪器 输液系统：心脏 高压泵 进样系统： 进样器 分离系统：关键 色谱柱 检测系统： 检测器 数据处理系统： 软件 高效液相色谱仪 1. 高压输液泵 它的功能就是将贮液瓶中的流动相连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离。 一、输液系统 恒流泵：能维持流量恒定不变 恒压泵：能保证泵出口液流压力基本不变 柱塞往复泵结构示意图 偏心轮 2. 柱塞 3. 密封垫 4. 液缸 5. 流动相入口 6. 流动相出口 7. 单向阀 高效液相色谱仪 泵的基本原理 往复活塞泵(单向阀) 弹簧隔板/红宝石球 串联柱塞泵 消除流量脉冲 并联柱塞泵 减小流量脉冲 高效液相色谱仪 仪器：四元泵 不是４个泵／必配真空脱气机／二元泵各控制一种溶剂 四元泵 ＭＧＧＶ在起作用 ＭＧＧＶ：比例阀 ＡＩＶ：　主动阀 ＯＢＶ：　单向阀 高效液相色谱仪 ①流量精度高且稳定； ②流量范围宽且可调； ③输出压力高； ④液缸容积小； ⑤密封性能好。 高压泵的性能要求是： 高效液相色谱仪 等强度洗脱： 梯度洗脱： 是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少、性质差别不大的试样。 是在一分析周期内经程序控制改变流动相组成的比例，从而调节流动相的极性、离子强度和PH值等，使所有组分都在适宜的条件下获得充分的分离。 2.梯度洗脱装置 高效液相色谱仪 系统中气泡的产生： 气泡的影响： —流动相本身存在，梯度淋洗混合后放出气泡； —导致实验结果偏差； —易造成液体回流，流量不准确； —出现鬼峰，影响检测准确性。 3. 真空脱气机 高效液相色谱仪 4. 过滤与脱气 过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机 盐配制的缓冲液。 脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响： 1、泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2、柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3、检测器中的气泡产生基线波动 高效液相色谱仪 高效液相色谱仪 二、进样系统 进样器是安装在色谱柱入口处，将试样送入色谱柱的装置。 手动进样：六通阀，进样量准确、重复性好 自动进样：定量、重复性好，适合大批量样品分析 高效液相色谱仪 六通阀定量环 仪器：手动进样器-六通阀/定量环 ”load”状态 ”inject”状态 六通阀处于充样“load”位置，用微量注射器将试样注入定量管。进样时，转动六通阀手柄至进样“inject”位置。 高效液相色谱仪 15 仪器：自动进样器 自动进样100样品盘/机器手/自动洗针 机械手 样品盘 高效液相色谱仪 分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。 三、分离系统 色谱柱是色谱仪的核心部件，各组分的分离就是在此完成 高效液相色谱仪 17 1.色谱柱 色谱柱是一根填满填料的管子，是液相色谱分离的关键； 柱管的材料： —硅胶基质 —聚合物基质 色谱柱的性能主要取决于填料的性质和填充技术。 高效液相色谱仪 色谱柱的一般结构 高效液相色谱仪 样品在经过色谱柱分离后，各个组分先后进入到检测器中，由检测器进行检测。 对检测器的一般要求为：灵敏度高、重复性好、线性范围宽、死体积小、对温度和流量的变化不敏感。 四、检测系统 高效液相色谱仪 1.紫外检测器 —A为吸光度，T为透射比，是透射光强度比上入射光强度； —E为摩尔吸收系数，它与吸收物质的性质及入射光的波长λ有关，C为吸光物质的浓度 l为吸收层厚度。 作用原理：依据被分析试样组分对特定波长紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光率的关系遵守比尔定律。 比尔—朗伯定律数学表达式 A=lg(1/T)=ECl 高效液相色谱仪 05 04 03 02 01 灵敏度高； 线形范围高； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。 紫外检测器的特点： 高效液相色谱仪 如：光电二极管阵列检测器 —紫外检测器的重要进展； —光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。 高效液相色谱仪 高效液相色谱仪 仪器：检测器-二极管阵列检测器 UV/Vis双灯，全波长检测 二极管阵列检测器 流路 高效液相色谱仪 2.示差折光检测器 原理：是通过连续测定样