20 高效液相色谱法（课件）- 《分析化学》同步教学（华中科大版）

第二十章 高效液相色谱法 1 2.熟悉 正相键合相色谱法及其分离条件的选择；高效液相色谱仪的构造；紫外和荧光检测器的检测原理。 3.了解 离子色谱法、手性色谱法和亲合色谱法及其常用固定相；溶剂极性和选择性，混合溶剂强度参数的计算。超高效液相色谱法；液质联用。 色谱法保留行为的主要影响因素和分离条件的选择；反相化学键合相的性质、特点、种类；速率理论及其对实验条件选择的指导作用。 1.掌握 章节目标 ●颗粒极细（一般10µm以下）、规则均匀的固定相，（键合相）传质阻抗小，柱效高，分离效率高； ●高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快； ●高灵敏度检测器，紫外检测器最小检测限可达10-9g，而荧光检测器最小检测限可达10-12g。 与经典液相色谱法相比的优点 ●不受试样挥发性和热稳定性限制，应用范围广； ●可选用各种溶剂作为流动相，对分离的选择性有 很大作用，选择性高； ●一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。 与气相色谱法相比的优点 第一节 高效液相色谱法的主要类型和原理 （一）基本类型色谱法 ◆ 分配色谱法（partition chromatography） ◆ 吸附色谱法（adsorption chromatography） ◆ 离子交换色谱法（ion exchange chromatography） ◆ 空间排阻色谱法（steric exclusion chromatography） 一、高效液相色谱法的主要类型 （二）其他类型色谱法 ◆ 亲合色谱法 (affinity chromatography,AC) ◆ 手性色谱法 (chiral chromatography,CC) ◆ 胶束色谱法(micellar chromatography ,MC) ◆ 电色谱法 (electrochromatography,EC) 第一节 高效液相色谱法的主要类型和原理 一、高效液相色谱法的主要类型 二、化学键合相色谱法 ●键合相色谱法：以化学键合相为固定相的色谱法， 简称键合相色谱法(bonded phase chromatography,BPC)。 ●化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键合在 载体表面所形成的固定相。 正相（normal phase，NP）键合相色谱法 反相（reversed phase，RP）键合相色谱法 第一节 高效液相色谱法的主要类型和原理 键合相色谱法的优点 1.固定相的均一性和稳定性好，不易流失，使用周期长； 2.柱效高； 3.重现性好； 4.使用的流动相和键合相的种类多，分离选择性高。 二、化学键合相色谱法 （一）正相键合相色谱法 ◇固定相：极性键合相，如氰基（－CN）、氨基（－NH2）或二羟基键合（经典：水饱和的硅胶） ◇流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调整剂，如烷烃加醇类（与水不混溶的溶剂） ◇适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物，如一些在硅胶柱上分离的物质。 （一）正相键合相色谱法 ★分离机制？ 分配：有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相解； 吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作用。 ★分离选择性？ 极性强的组分k大，后洗脱出柱； 流动相极性增强，洗脱能力增加，k↓，tR ↓ 。 （二）反相键合相色谱法 ◇固定相：非极性键合相，如十八烷基硅烷(C18，ODS)、辛烷基(C8)键合硅胶。 ◇流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调整剂，常用甲醇－水、乙腈－水等。 ◇应用范围：最广非极性至中等极性的组分，还有有机酸、碱及盐等。 反相键合相色谱法保留机制 ★疏溶剂 （solvophobic theory）？ 溶质的保留主要是溶质分子与 极性溶剂分子间的排斥力，促使 溶质分子与键合相的烃基发生疏 水缔合。不是溶质分子与键合相 间的色散力。 反相色谱法保留行为的主要影响因素 1.溶质的分子结构（极性） 极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。 同系物碳数越多，极性越弱，k越大； 引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。 2.固定相 键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质k增大。 硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越大。 反相色谱法保留行为的主要影响因素 3、流动相 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大； ① 溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂； ② 溶剂比例：水的比例增加，使k增大； ③ 中性盐的加入：使中