第十七章 毛细管电泳法（课件）- 《分析化学》第三课时同步教学（人卫版第9版）

Analytical Chemistry 第十七章 毛细管电泳法 分析化学 1. 仪器流程与主要部件 电压：0～30kV； 分离柱不涂敷任何固定液； 紫外或激光诱导荧光检测器； （可检测到：10-19～10-21 mol/L） 高压电源 （1）0～30 kV 稳定、连续可调的直流电源； （2）具有恒压、恒流、恒功率输出； （3）电场强度程序控制系统； （4）电压稳定性：0.1%； （5）电源极性易转换； 毛细管柱 （1）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械性能差； （2）规格：内径20～75μm，外径350～400μm；长度<=1m 毛细管是CE分离的心脏。理想的毛细管必须是电绝缘、紫外/可见光透明且富有弹性的，目前可以使用的有玻璃、熔融石英或聚四氟乙烯塑料等。毛细管内径一般为10～100μm，其截面结构图标意图如图17.23所示。 毛细管结构 缓冲液池 化学惰性，机械稳定性好； 检测器 要求：具有极高灵敏度，可柱端检测； 检测器、数据采集与计算机数据处理一体化； 类型 检测限/mol 特点 紫外-可见 10-13～10-15 加二极管阵列，光谱信息 荧光 10-15～10-17 灵敏度高，样品需衍生 激光诱导荧光 10-18～10-20 灵敏度极高，样品需衍生 电导 10-18～10-19 离子灵敏，需专用的装置 紫外吸收检测 小分子检测 有紫外吸收 首先选择二极管阵列检测器或紫外检测器 无紫外吸收 可以衍生化的，可以采用自外衍生的方法再用紫外检测器检测，如氨基酸、还原性糖等 不可以衍生化的，可采用间接紫外法用紫外检测器检测，也可以尝试电化学检测器 有荧光或需要高灵敏度检测的可采用激光诱导荧光（LIF）检测器 需要测定结构或者难以用光学检测器检测的，可以考虑质谱检测 大分子检测 蛋白、核酸 可以首先选择紫外检测器 如果需要高灵敏度检测可以采用柱前或者柱上衍生的方法标记荧光，然后用LIF检测 如果需要特异性检测，可使用特异性荧光探针，标记后再LIF检测 需要测定分子量或氨基酸序列，可采用质谱检测 多糖 含量较高的多糖可以采用末端吸收法以紫外检测器检测 含量较低的还原性多糖可用衍生试剂标记后以LIF、UV的方式检测 2. 毛细管电泳的进样方式 进样量：毛细管长度的1%-2%；纳升级、非常小； 流体力学进样方式 （1）进样端加压 （2）出口端抽真空 （3）虹吸进样 毛细管一端插入样品瓶，加电压； 电动进样方式 进样不均：电歧视现象，淌度大的离子比淌度大的进样量大； 离子丢失：淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进不去； 特别适合黏度大的试样； 扩散进样 试样通过扩散作用进入分离柱端口处。 毛细管电泳的分类1 1. 毛细管区带电泳 2. 毛细管凝胶电泳 3. 胶束电动毛细管色谱 4. 毛细管等电聚焦 5. 毛细管等速电泳 6. 亲和毛细管电泳 7. 毛细管电色谱 毛细管电泳的分类2 按分离模式可分为三大类 电泳型 毛细管区带电泳 毛细管凝胶电泳 毛细管等电聚焦电泳 毛细管等速电泳 色谱型 毛细管电色谱 胶束电动毛细管色谱 亲和毛细管电泳 微乳液电动毛细管色谱 电泳/色谱型 √ √ √ √ √ √ √ 1. 毛细管区带电泳（毛细管自由电泳） capillary zone electrophoresis ，CZE 带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。 阳离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离子：两种效应的运动方向相反；ν电渗流 >ν电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。 最基本、应用广的分离模式； 中性分子 阳离子 阴离子 分离机理 在只填充缓冲溶液的毛细管中，不同质荷比大小的组分在电场的作用下因淌度不同而进行分离。 在毛细管中，由于电渗流的存在，所有溶质都随电渗流一起向负极迁移。 在CZE中可以实现正负离子（或粒子）的同时分离,中性粒子随电渗流一起流出毛细管,不能分离（图谱上是一个峰） 。 组分的检出顺序为： 阳离子（正粒子）＞中性粒子＞阴离子（负粒子） 毛细管区带电泳溶质的迁移规律小结： 影