第十五章 高效液相色谱法（课件）- 《分析化学》第一课时同步教学（人卫版第9版）

Analytical Chemistry 第十五章 高效液相色谱法 分析化学 分析化学 高效液相色谱特点与仪器 流程 特点与应用 1. 高效液相色谱法的特点 特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。 2. 高效液相色谱法的应用 化合物的分离、鉴定、纯化以及定量。 溶质在液体中的扩散系数比气体中约小105倍 液体粘度比气体约大102倍 液体表面张力比气体约大104倍 液体密度比气体约大103倍 液体不可压缩 HPLC与GC的差别 1．分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测; 占有机物的20% HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的80% 2．流动相差别的区别 GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改 变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分离选择性。 3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） HPLC几乎在所有学科领域都有广泛应用，可以用于绝大多数物质成分的分离分析，它和气相色谱都是应用最广泛的仪器分析技术. 主要部件 (1) 高压输液泵 主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性 (2) 梯度淋洗装置 外梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。 内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。 流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示： (3) 进样装置 (4) 高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 (5) 液相色谱检测器 a. 紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： 灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm × 10mm ，容积 8μL）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。 b. 光电二极管阵列检测器 光电二极管阵列检测器：1024个（或更多）二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。 实际上也是一种紫外检测器，但是可以在不停泵的情况下获得光谱图，从而绘制三维图（时间－强度－波长）。 c. 示差折光检测器 除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比； 通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）； 灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱； 偏转式、反射式和干涉型三种； d. 荧光检测器 高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应； 有几种不同的形式，如： （1）专门设计的与HPLC配套的荧光检测器，如安捷伦1200色谱仪； （2）利用现有的荧光分光光度计，如日立2500型荧光仪配有专门的附件； （3）激光诱导荧光(LIF)：Laser Induced Fluorescence，体积小，适合毛细管柱 电学和电化学检测器： 安培检测器 电导检测器 库仑检测器 介电常数检测器 极谱检测器 基于热学性质的检测器： 光声检测器 热透镜和光热偏转检测器 与其他大型仪器联用： 质谱检测器（液相色谱与质谱联用） 核磁检测器(液相色谱与核磁