第九章 荧光分析法（课件）- 《分析化学》第一课时同步教学（人卫版第9版）

荧光分析法 下村修，1962年从一种水母中发现了绿色荧光蛋白，被誉为生物发光研究第一人。 马丁·沙尔菲，主要贡献在于向人们展示了绿色荧光蛋白作为发光的遗传标签的作用。诺贝尔奖评审委员会说，这种蛋白已经成为同时代生物科学研究最重要的工具之一。 钱永健，主要贡献是利用水母发出绿色荧光蛋白来示踪实验室内进行的生物反应，他被认为是这方面的先驱。 2008年诺贝尔化学奖 2 绿色荧光蛋白能享有今日的“尊荣”，这3人的贡献都不可或缺。首先发现绿色荧光蛋白的是生于1928年的下村修。他1962年从生活在美国西海岸近海的一种水母身上分离出了绿色荧光蛋白。瑞典皇家科学院在公报中说，在上世纪90年代，沙尔菲指出绿色荧光蛋白的发光特性在生物示踪方面有极高价值，钱永健则为理解绿色荧光蛋白怎么发光做出了贡献。在今年获得化学奖的3人中，钱永健走出的可说是绿色荧光蛋白开发历程的“最后一步”，他在下村修与沙尔菲研究的基础上进一步搞清楚了绿色荧光蛋白特性。他改造绿色荧光蛋白，通过改变其氨基酸排序，造出能吸收、发出不同颜色光的荧光蛋白，其中包括蓝色、青色和黄色，并让它们发光更久、更强烈。瑞典皇家科学院在公报上说：“这也正是研究人员今天能用不同的颜色标记不同的蛋白质、观察它们相互作用的原因。” 野生型GFP可发出很绚丽的荧光，但它存在有两个激发峰、光稳定性不好，在37℃不能正确折叠等缺点。 GFP结构示意图 钱永健对GFP进行改造，使其荧光更强，并且丰富了颜色种类，令GFP家族变得绚丽多彩。 3 GFP由238个氨基酸组成，分子量为26.9 kDa，最初是从维多利亚多管发光水母中分离出来的，在蓝光照射下会发出绿色荧光。GFP在水母中之所以能发光，是因为水母素和GFP之间发生了能量转移。水母素在钙刺激下发光，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。这是物理化学中已知的荧光共振能量转移(FRET)在生物中的发现。尽管野生型GFP发出很绚丽的荧光，但它还是有不少缺点，比如有两个激发峰、光稳定性不好，在37℃不能正确折叠。研究人员通过定点或随机突变，不断地改造这些残基，得到了我们今天使用的GFP衍生物。 首个重大改变就是钱永健在1995年完成的单点突变（S65T）。这个突变显著提高了GFP的光谱性质，荧光强度和光稳定性也大大增强。突变后的GFP激发峰转移至488 nm，而发射峰仍保持在509 nm，这和常用的FITC滤光片匹配，提高了GFP的应用潜力。而F64L点突变则改善了GFP在37℃的折叠能力，综上就产生了增强型GFP，也就是我们常见的EGFP。 其他的突变还包括颜色突变，这其中大部分也是钱永健的功劳。现在有蓝色荧光蛋白（EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1）、青色荧光蛋白（ECFP, Cerulean, CyPet）和黄色荧光蛋白（YFP, Citrine, Venus, Ypet）。 你知道下面的发光原理吗？ 焰火 荧光灯 磷火（鬼火） 荧光棒 萤火虫 分子发光 Molecular Luminescence 分子荧光 分子磷光 化学发光 生物发光 光致发光：分子吸收了光能而被激发至较高能态，在返回基态时，发射出与吸收光波长相等或不等的辐射，这种现象称为光致发光。 化学发光：化学反应中，产物分子吸收了反应过程中释放的化学能而被激发，在返回基态时发出光辐射。 荧光（fluorescence）现象的第一次记录： 1575年，西班牙内科医生和植物学家N. Monardes，观察到Lignum Nephriticum愈创木切片的水溶液呈现天蓝色。 第一次被提出用于分析： 1864年，Stokes 第一次用于分析： 1867年，Goppelsröder根据 Al-桑色素配合物的荧光，建立 了Al3+的荧光测定方法。 George Gabriel Stokes (1819-1903) 参考文献： 陈国珍，黄贤智，郑本梓，许金钩，王尊 本，荧光分析法，科学出版社，北京，1990 Joseph R. Lakowicz, Principle of Fluorescence Spectroscopy, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 1999 单击此处编辑母版文本样式 第二级 第三级 第四级 第五级 基态单重态S 激发态单重态S 激发态三重态T 10-8s 10-4 - 1s 基本原理 荧光和磷光的产生 1．单重态和三重态 基态单重态(singlet state)：自旋电子成对,只有一种自旋方向↑↓,电子自旋总和是零，光谱项的多重