备课素材：微卫星DNA分子标记-2023-2024学年高二上学期生物人教版选择性必修2

微卫星DNA分子标记 2019版高中生物学选择性必修二第6页“生物科技进展”，调查种群数量的其他方法中，研究者通过采集大量大熊猫的粪便，通过分析其中的微卫星DNA分子标记，查明在2003年到2004年，这些地区大熊猫的种群数量为66只，其中雄性35只，雌性31只。 那么什么是微卫星DNA分子标记？ 一  微卫星序列简介     微卫星(microsatellite)又称简单序列重复(simple sequence repeats, SSR)，是指以少数几个核苷酸(一般为1～6个)经多次重复单位组成的简单多次串联重复序列，如(CA)n、(TG)n等；又被称为短串联重复序列。简单序列重复其长度大多在100bp以内。根据微卫星的结构，Weber(1991)等将其分为3类，即完全的(perfect)、不完全的(imperfect)和复合的(compound)微卫星。完全的微卫星是指由不中断的重复单位构成的微卫星；不完全的微卫星其重复序列中间有3个以下的非重复碱基，两侧不中断的部分重复数大于3；复合的微卫星则指两类或两类以上的串联重复单位由3个连续的非重复碱基分隔开，但不中断的重复单位的重复数不小于5。 尽管微卫星在进化上是一类中性的分子遗传标记，但现在发现微卫星DNA在基因组中具有非常重要的功能和作用。主要有以下几种功能：微卫星作用于染色质组织，包括染色体组织、DNA结构、着丝粒和端粒等；微卫星调节DNA代谢，包括DNA复制、DNA重组、MMR错配修复系统和细胞周期的调节；微卫星可以调节基因活性，包括基因转录、蛋白质结合和基因翻译的调节，如下图所示。 二  微卫星标记技术的一般流程     微卫星分析的关键在于开发基因组中某个微卫星两侧的引物序列。如果有现成的微卫星引物，在PCR扩增后，即可利用电泳技术进行分析。以下根据流程的先后，分4个步骤进行介绍，前两步是为开发新的微卫星引物所必需的。一般的实验室应用已知的微卫星引物进行多态性分析，只需掌握后两步即可。 1.微卫星序列的获得 微卫星序列的获得是微卫星分析的第一步，也是最复杂的一步。在使用微卫星方法之前，如何获得所需要的微卫星位点大致有4条途径：①寻找已存在的微卫星引物；②使用与所研究物种亲缘关系较近物种的引物；③用经典分子生物学方法克隆所需要的微卫星位点；④从RAPD标记中获得微卫星DNA。 2.微卫星引物的设计 由于微卫星两侧的序列在同一物种间是高度保守的，即可据此设计引物，用以扩增同一物种，甚至不同物种其他基因型的微卫星片段。微卫星引物设计的原则同一般PCR扩增引物的设计，简单地讲，微卫星重复序列两侧的引物在基因组内应具有高度的专一性。每条引物一般为18～24个核苷酸。(G+C)％含量接近50％(Tm值为60℃左右)，避免引物内二级结构的产生及某个核苷酸的连续出现。3'末端最好富含GC，PCR的扩增产物在100～300bp之间。 3.PCR扩增 设计引物，进行微卫星特异性扩增，其重现性和稳定性都较好。但由于每对引物的(G+C)％含量不同、扩增产物的长度有异，因此，有必要给每对引物摸索一个合适的扩增条件。一般可通过改变退火温度、缓冲液中Mg2+的浓度及循环数来获得清晰可靠的条带。Tautz在讨论这一问题时指出，当第一对引物扩增到后期时，可通过加入另一个与目标序列互补的引物来去除那些由于引物与其他位点的同源性而产生的非相关扩增条带。但他同时也指出，尽管通过多次预实验来改变反应条件，也不能完全避免某些PCR扩增所带来的假带。 4.扩增产物进行检测 在SSR-PCR扩增以后，要对扩增产物进行检测。一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳或者特殊的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。利用银染来检测扩增产物，可避免操作放射性核素的危险，也不会降低灵敏度。银染的分辨率很高，能检测出1ng以下的DNA。用聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行检测时，通常PCR产物在变性聚丙烯酰胺序列胶上的分离效果优于非变性胶上的分离效果。因为杂合个体在PCR后期的循环中会产生异源双链分子，导致在杂合的情况下胶中产生了3条带甚至是4条带，而不是正常的两条带。这种情况出现会干扰等位基因的统计。SSR-PCR扩增产物在5％～8％(质量浓度)的变性聚丙烯酰胺序列胶上分离后，微卫星DNA中1～2个核苷酸的变化可以分辨出来。每个PCR反应物占据1个电泳泳道，进行序列胶电泳时使用的上样梳具有25～30个样孔，因此每板电泳可同时分析25～50个个体中等位基因的精确变化，这种方法适于作群体遗传的研究。但聚丙烯酰胺凝胶电泳操作起来总没有琼脂糖凝胶电泳那样得心应手。Wu等在检测水稻13个微卫星的多态性时，有3个经过4％的琼脂糖凝胶电泳在两个亲本间找到了多态。 5.数据分析 微卫星位点可以提供大量的信息，对少量的数据分析，可以直接进行计算和比对；对于大群体