备课素材：PCR基因定点突变-2023——2024学年度第一学期高中生物学选择性必修三

PCR基因定点突变 PCR定点突变是最常用的基因定点突变技术，以PCR为基础的突变方法优点很多，如突变效率高、可以任意定点诱变、快速简单等。通过设计含有非特异性配对碱基的引物，再通过PCR将突变位点引入产物中。PCR定点突变技术具有突变回收率高、可在任何位点引入突变、材料和试剂容易获得、操作简单等优点，它又可以分为重叠延伸PCR、大引物PCR等。 1.重叠延伸PCR   重叠延伸PCR是发展最早的PCR定点突变技术。如下图所示，该技术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基（包括突变位点）是可以互补的。因此，分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。 重叠延伸PCR能将突变碱基加入至DNA的内部。但是这种方法往往需要三轮PCR才能获得产物，过程繁琐。 例1.利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理性改造，其过程如下图所示。下列分析不正确的是（      ） A.PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引物b扩增的结果 B.引物c和引物b上均含有与模板链不能互补的碱基 C.①过程需要先加热至90 ℃以上后再冷却至50 ℃左右 D.②过程需要利用引物a和引物d获得突变产物AD 答案：D 2.大引物PCR 由于重叠延伸PCR需要三轮PCR才能获得大量突变DNA,多轮PCR因引物的改变要将PCR产物进行试管的转移，而这种转移容易造成样品遭受环境污染。有学者巧妙地设计出只需要两轮PCR即可获得突变DNA的方法，即大引物PCR法。 大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。该技术的流程如图所示。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。 大引物PCR的巧妙之处在于摒弃了在突变碱基上下游分段、分别PCR的思路，将第一轮PCR出的产物作为第二轮PCR的引物，直接获得了突变DNA。但是这种方法依旧存在试管转移的问题。可以将第二轮PCR中下游引物长度设计地比第一轮上游引物长一些，这样就可以通过适当提高退火温度以抑制上游引物在第二轮中与模板链的结合。 例2.大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行2轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。请分析回答下列问题： （1）引物结合到互补DNA链时的温度称退火温度，常规PCR设定的退火温度通常是____。为了使两轮PCR反应在同一支试管中进行，引物设计时应考虑不同的退火温度，第二轮PCR的退火温度应该比第一轮____，第二轮PCR仍需加入的引物是____。 答案：55-60℃   高    (另一种)健翼引物 学科网（北京）股份有限公司 $$